響應面優化魚鰾膠原肽制備工藝及其抗氧化活性研究

涂宗財，唐平平，鄭婷婷，龐娟娟，張露，沙小梅，王輝

1(江西師范大學 功能有機小分子教育部重點實驗室&生命科學學院，江西 南昌，330022)2(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

響應面優化魚鰾膠原肽制備工藝及其抗氧化活性研究

涂宗財1,2*，唐平平1，鄭婷婷1，龐娟娟1，張露1，沙小梅1，王輝2

1(江西師范大學 功能有機小分子教育部重點實驗室&生命科學學院，江西 南昌，330022)2(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

魚鰾富含膠原蛋白，營養價值高，但目前對魚鰾的加工利用不足，造成資源浪費、環境污染。以草魚魚鰾為原料，以DPPH自由基清除能力為評價指標，通過單因素和響應面實驗優化酶解魚鰾膠原蛋白制備抗氧化活性肽的最佳工藝，并研究其體外抗氧化活性。結果表明：抗氧化活性肽的最佳制備工藝為，以風味蛋白酶為酶制劑，酶解時間79.34 min，料液比為3.09∶100(g∶mL)，酶添加量為6 343.43 U/g，在此條件下制備的魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力達79.98%。魚鰾膠原肽清除DPPH自由基、羥自由基的IC50分別為8.05 mg/mL和3.54 mg/mL，并且具有較強的還原力。因此，魚鰾膠原肽具有較強的抗氧化活性，草魚魚鰾是制備抗氧化活性肽的良好原料。

魚鰾；膠原蛋白；肽；抗氧化活性

活性氧自由基(ROS)是有氧生物細胞代謝過程中產生的一類高活性物質。在機體內，自由基會不斷被體內抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)清除。當人體中ROS過量時，易導致一系列人類疾病，如神經退化、糖尿病、衰老、癌癥等[1-2]。ROS中DPPH自由基活性最高，羥自由基毒性最強，超氧陰離子自由基可導致機體中毒。目前使用的自由基清除劑主要有BHA、BHT、TBHQ等，但這些抗氧化劑為合成抗氧化劑，易引發DNA、蛋白質損傷及本身的毒性危害[3]。因此，從食源蛋白中提取天然抗氧化活性肽已逐漸成為研究熱點之一。

魚加工過程中產生大約40%的副產物，其中魚鰾約占1%[4]，根據2016漁業年鑒統計結果，2015年草魚的總產量567.62萬t計算，魚鰾產量約為2.27萬t，產量較大。且魚鰾富含膠質，膠原蛋白含量高達80%以上[5]，可作為良好、豐富的膠原蛋白資源。但是，目前除少部分魚鰾(特別是淡水魚魚鰾)直接被食用或加工為干制品外，大部分被當做廢棄物丟棄，造成大量的資源浪費和嚴重的環境污染。膠原蛋白肽是膠原蛋白經酶降解得到的一系列由3～20個氨基酸組成的多肽[6]。研究表明，水產品尤其是魚類加工副產物可制備具有抗氧化活性的膠原肽，目前國內外研究者已從魚皮[7-9]、魚骨[10-12]、魚鱗[13-14]等副產物中制備除抗氧化膠原肽。但目前對魚鰾膠原肽研究極少，只有劉姝[15]等直接以鳙魚魚鰾原材料，通過米曲霉發酵制備抗氧化活性肽，但該法耗時長，達40 h，且產物的抗氧化活性不高，超氧陰防子自由基和羥自由基的清除率分別為52%和78%。

針對魚鰾資源加工利用不足，魚鰾膠原肽研究不夠深入，魚源膠原肽活性不高等問題，本文先從草魚(Ctenopharyngodonidellus)魚鰾中提取明膠，然后以DPPH自由基清除率為指標，采用酶法降解魚鰾明膠，通過單因素及響應面試驗優化魚鰾明膠制備抗氧化膠原肽的制備工藝，并對其體外抗氧化活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚魚鰾(平均長度(20.3±1.4) cm、質量(15.29±2.5) g)，由南昌市鄱陽湖農牧漁產業發展股份有限公司提供，魚鰾在公司經冷庫冰凍，加冰塊包裝好1 h內運送到實驗室，新鮮魚鰾經清洗后放-20℃保存備用(1個月內使用)。

風味蛋白酶(2.6×104U/g)、堿性蛋白酶(17.3×104U/g)、中性蛋白酶(5.0×104U/g)，諾維信生物技術有限公司；胰蛋白酶(26.7×104U/g)、木瓜蛋白酶(17.1×104U/g)，江蘇銳陽生物技術有限公司；1,1-二苯基-3-硝基苯肼，美國Sigma公司；還原型谷胱甘肽，北京索萊寶有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器和設備

LGJ-1D-80型冷凍干燥機，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；ESJ200-4型電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；UV-3200型紫外-可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；synergH1型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；5430R型離心機，艾本德中國有限公司；KDY-9820型凱氏定氮儀，北京瑞邦興業科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚鰾明膠的提取[16]

稱取適量的草魚魚鰾，剪成(1 cm×1 cm)的小塊，按料液比1∶3(g∶mL)加入0.15%的NaOH，浸泡1 h后水洗至中性，再按1∶3的料液比加0.15%的H2SO4溶液，靜置1 h后水洗至中性，最后用80 ℃熱水浸提2 h，雙層濾紙過濾，濾液冷凍干燥后備用。

1.3.2 魚鰾明膠蛋白含量的測定[17]

參照GB 5009.5—2010《國家食品安全標準 食品中蛋白的測定》中凱氏定氮法測定魚鰾明膠蛋白質含量。

1.3.3 蛋白酶的選擇

將魚鰾明膠配制成蛋白質含量為20 mg/mL的溶液，加酶酶解，酶解條件見表1。酶解結束后，沸水浴滅酶10 min，7 500 r/min離心10 min，取上清液測定DPPH自由基清除率和游離氨基氮含量，篩選出最適蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.3.4 酶解工藝研究

1.3.4.1 單因素試驗

通過1.3.2篩選出水解魚鰾明膠的最適酶，以酶解液的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量為指標進行單因素實驗。分別研究料液比(g∶mL)(1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100)、酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)、反應pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、反應時間(15、30、45、60、75、90 min)、酶添加量[E/S](2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g)對魚鰾明膠酶解液DPPH自由基清除率和游離氨基氮含量的影響。

1.3.4.2 響應面試驗

在單因素的基礎上，以DPPH自由基清除率為響應值，選擇對酶解產物抗氧化性影響較強的3個因素(酶添加量、反應時間、料液比)進行3因素3水平的響應面試驗。

1.3.5 游離氨基氮含量的測定

采用茚三酮法[18]測定游離氨基氮含量。

1.3.6 抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH·清除能力測定[19]

用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH，取100 μL酶解液與100 μL DPPH溶液于96孔酶標板混合均勻，常溫避光反應30 min，517 nm處測定吸光值A1。以100 μL 95%乙醇代替DPPH溶液與100 μL去離子水反應為空白組(A0)，以100 μL DPPH溶液與100 μL去離子水反應為對照組(A2)。DPPH·清除率計算公式如下：

DPPH自由基清除率/%=(A2-A1)/(A2-A0)×100

(1)

1.3.6.2 羥自由基清除能力的測定[20]

取1.0 mL酶解液依次加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4，1.5 mL 1.8 mmol/L 水楊酸-乙醇和0.1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37℃水浴30 min。反應結束后取200 uL混合液于96孔酶標板，510 nm處測定吸光值Ai，以去離子代替樣品液的吸光值為A0。羥自由基清除活性計算公式如下：

羥自由基清除率/%=[(A0-Ai)/A0]×100

(2)

1.3.6.3 還原力的測定

采用鐵氰化鉀還原法[21]測定水解產物的還原能力。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1-A可知，5種蛋白酶中以風味蛋白酶制備的肽具有最高的DPPH自由基清除能力，達到73.71%，其后依次是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶。由于游離氨基含量可間接反應出蛋白質水解度，酶解液中游離氨基含量越高，水解度越大[22]。從圖1-B中可以看出，風味蛋白酶水解液中游離氨基氮含量最高，達到3 236.38 μg/mL。由此可知，在酶活力及酶解時間相同情況下，風味蛋白酶酶解魚鰾明膠的效率最高，制備得到的肽具有最強的抗氧化活性，因此，選擇風味蛋白酶為后續試驗優化魚鰾膠原肽制備工藝的蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶酶解對魚鰾膠原肽DPPH清除率(A)及游離氨基氮含量(B)的影響Fig.1 Effect of protease on DPPHscavenging rate(A) and free amino nitrogen content(B) of collagen peptide from swimming bladder

2.2 風味蛋白酶酶解魚鰾明膠制備抗氧化肽單因素試驗

如圖2-A所示，pH值為6.0時，魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量均達到最大。這可能是由于酶具有最適pH，pH值過高或過低都會降低酶的活力[23]。圖2-A中結果表明，風味蛋白酶對魚鰾明膠的最適pH值為6.0，過高或過低均可降低膠原肽的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量，表明6.0為風味蛋白酶制備魚鰾明膠抗氧化肽的最適pH值。

圖2 pH(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)、酶添加量(D)、料液比(E)對魚鰾膠原肽DPPH清除率及游離氨基氮含量的影響Fig.2 Effect of pH(A)、 temperature(B)、 hydrolytic time(C)、 emzyme concentration(D)、liquid-to-material(E)on DPPH scavenging rate and free amino nitrogen content of collagen peptide from swimming bladder

由圖2-B可以看出，隨著酶解溫度升高，魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量呈先增大后降低的趨勢，當酶解溫度達到50 ℃時，具有最高的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量，分別為72.25%和3 409.28 μg/mL，這可能是因為溫度過高會導致酶活力降低甚至失活[24]。因此，風味蛋白酶酶解的較適溫度為50 ℃。

圖2-C表明，隨著反應時間的延長，魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量越來越高。當酶解時間為75 min時達到最高，隨后降低，游離氨基氮含量則平緩降低。這可能是因為酶解反應到一定時間后，進一步酶解會切斷一些抗氧化多肽片段[25]，導致酶解液DPPH自由基清除率的降低。綜合考慮，酶解時間定為75 min。

由圖2-D可知，魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量隨著酶添加量的增加呈先升高后趨于平緩的趨勢。這可能是因為隨著酶量的增加，酶與底物達到飽和，酶進一步添加DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量不再增加。當酶添加量為6 000 U/g魚鰾明膠蛋白時，DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量最高。因此，選擇最適酶添加量為6 000 U/g。

從圖2-E的結果可知，料液比在(1∶100～3∶100)(g∶mL)范圍內，隨著料液比的升高魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量逐漸增大；料液比超過3∶100后，進一步增大料液比魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量開始緩慢降低。這可能是由于料液比較低時，酶量多于底物，隨著料液比增加，底物濃度升高，底物多于酶量，進一步增加已沒有多余的酶與底物反應[26]。因此，最適料液比為3∶100。

2.3 響應面試驗

響應面試驗結果如表2所示，用Design Expert 8.0軟件對上述結果進行分析，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果

軟件分析結果得到二次多項式回歸方程為：

R=79.66+1.4X1+0.9X2+0.97X3-0.06X1X2+0.34X1X3-1.08X2X3-2.42X12-4.16X22-2.57X32

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，模型P<0.000 1表示模型為極顯著。失擬項P值為0.1155(大于0.05)，表示模型預測值與實際誤差值較小。分析模型各系數的P值可

得，因素X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32項的P<0.05，說明反應時間、料液比和酶添加量的一次項和二次項，以及料液比和酶添加量的交互作用對魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力具有顯著影響。通過對DPPH自由基清除率的回歸方程進行顯著性檢驗發現，模型相關系數R2=0.979 8，表示預測值與實測值之間具有很高的相關性；Radj2=0.953 8，表明此模型能解釋95.38%的響應值變化，僅有總變異的4.62%不能解釋。因此，該模型可以描述風味蛋白酶對草魚魚鰾明膠酶解制備膠原肽的變化規律，此模型能較好的優化試驗方案。剔除不顯著項X1X2、X1X3，再對方程進行優化，得方程：R=79.66+1.4X1+0.9X2+0.97X3-1.08X2X3-2.42X12-4.16X22-2.57X32

圖3為料液比與酶添加量的等高線和響應面圖。

圖3 料液比和酶添加量對DPPH自由基清除率影響的響應面圖與等高線圖Fig.3 Ration of solid to liquid and cmzyme content on DPPH scavenging rate of response surface chart and contour plots

等高線的形狀可反應交互作用的強弱，橢圓表示交互作用顯著，圓形則表示不顯著。圖3可知，料液比與酶添加量之間具有顯著的交互作用，這與表3的結果一致。采用軟件分析得到風味蛋白酶酶解魚鰾明膠的最優工藝條件：反應時間為79.34 min、料液比為3.09∶100、酶添加量6 343.43 U/g。此時魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率理論值可達79.98%。按照該條件進行DPPH自由基清除率的驗證性實驗，重復6次計算平均值，DPPH自由基清除率為81.25%。與理論值的相對誤差為1.57%。說明此模型可以較好的模擬和預測魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率。

2.4 魚鰾膠原肽抗氧化活性研究

以魚鰾膠原蛋白為原料，采用風味蛋白酶在最佳酶解條件制備膠原肽，并對膠原肽的抗DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原力進行測定，結果見圖4。

圖4 魚鰾膠原肽的抗氧化活性：(A)DPPH自由基清除率、(B)羥自由基清除率、(C)還原力Fig.4 Antioxidant activity of collagen peptide from swimming bladder(a)，DPPH scavenging rate，(b)OH scavenging rate and (c) reducing power

由圖4-A可知，隨著魚鰾膠原肽濃度的增加，樣品對DPPH自由基的清除率逐漸升高，30 mg/mL達到最高81.27%，其IC50值為8.05 mg/mL。劉成梅[27]等研究的羅非魚皮多肽(TSP-1)DPPH自由基清除率的IC50為13.96 mg/mL。劉文穎[28]等報道三文魚魚皮膠原肽對DPPH自由基清除率的IC50為14.95 mg/mL；夏光華[29]等采用三酶法制備羅非魚皮膠原肽，其清除DPPH自由基的IC50為10.78 mg/mL。尹利端[30]等制備的鯉魚魚鱗膠原肽對DPPH自由基清除率的IC50為18.24 mg/mL。與這2種魚皮膠原肽的DPPH自由基清除率相比，魚鰾膠原肽具有更高的DPPH自由基清除能力，但稍低于綠鰭馬面鲀魚皮膠原肽[31]的IC50為5.22 mg/mL，低于譚洪亮[12]等分離純化了的金槍魚骨膠原肽的DPPH自由基清除能力(IC50=0.97 mg/mL)，這可能是因為魚鰾膠原肽是粗酶解物，未經進一步的分離純化。

從圖4-B可知，在0～15 mg/mL內，魚鰾膠原肽的羥自由基清除率隨著濃度增大而升高，15 mg/mL后升高緩慢，IC50為3.54 mg/mL。馬華威[32]等以鮟鱇魚皮制備膠原活性肽，其對羥自由基清除的IC50為15.7 mg/mL。梁鵬[33]等研究了鯰魚骨酶解物的羥自由基清除能力，IC50為6.47 mg/mL；尹利端[30]等以鯉魚魚鱗為原料制備膠原肽，其清除羥自由基的IC50為12.11 mg/mL。這3種膠原肽的羥自由基清除能力均低于本文的魚鰾膠原肽。

圖4-C結果可看出，魚鰾膠原肽的還原能力具有良好的量效關系。隨著多肽濃度升高，還原能力越來越強，當濃度達到30 mg/mL時，還原力相當于相同濃度下VC的一半。任俊鳳[34]等對河豚魚皮膠原肽進行超濾分離得到3 000～10 000 Da和1 000～3 000 Da和1 000 Da以下的3個肽段，其在濃度為30 mg/mL下的OD700 nm的值不到0.8。楊露[11]等制備的馬面魚骨多肽在60 mg/mL的OD700 nm的值僅約為0.6。2種膠原肽還原力均顯著低于魚鰾膠原肽。魚鰾膠原肽具有較強的還原力。雖然魚鰾膠原肽的DPPH自由基、羥自由基清除能力和還原力均低于VC和還原型谷胱甘肽，但優于大部分的魚皮、魚骨、魚鱗膠原肽。綜上，通過對魚鰾膠原肽的體外抗氧化能力研究，表明魚鰾膠原肽具有較強的抗氧化能力。

3 結論

魚鰾為富含膠原蛋白的藥食兩用資源，但其加工利用程度卻不高，本文通過單因素及響應面試驗對草魚魚鰾明膠制備抗氧化肽的酶解工藝進行優化。確定最優工藝條件為：風味蛋白酶，酶解時間79.34 min，料液比為3.09∶100(g∶mL)，酶添加量為6 343.43 U/g，此時的DPPH自由基清除率達79.98%。體外抗氧化活性研究顯示，魚鰾膠原肽清除DPPH自由基和羥自由基的IC50分別為8.05 mg/mL和3.54 mg/mL，且具有較強的還原力，當質量濃度為30 mg/mL時，700nm處的吸光值達1.432 8。因此，魚鰾明膠酶解產物具有較強的抗氧化能力，可作為制備抗氧化活性肽的資源，本研究對促進魚鰾資源的開發和高值化利用具有重要參考意義。

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Optimization of swimming bladder collagen peptide preparation using response surface methodology and its antioxidant activity research

TU Zong-cai1,2*, TANG Ping-ping1, ZHENG Ting-ting1, PANG Juan-juan1,ZHANG Lu1, SHA Xiao-mei1, WANG Hui2

1(Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule, Ministry of Education, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)2(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Swim bladder is rich in collagen, high in nutrition, but it is waste and cause environmental pollution due to lack of processing technology, causing severe waste and environmental pollution. The technology parameters of enzymatic hydrolysis swim bladder in preparing collagen peptide through single factor experiment and response surface methodology was optimized, DPPH· scavenging ability was used as the indicator. The antioxidant activities of peptide prepared under the optimal condition were also evaluated. Results indicated that the optimal conditions for preparing antioxidant peptides were: Flavourzyme hydrolyzing for 79.34 min, liquid-to-material of 3.09%, emzyme-collagen ratio of 6 343.43 U/g. Under the above conditions, the DPPH· scavenging ability of swim bladder collagen peptide was 79.98%. The IC50value for DPPH· and ·OH scavenging ability was 8.05 mg/mL and 3.54 mg/mL, respectively. The peptide also exhibited relatively strong reducing power. Therefore, swim bladder is a good source in preparing swim bladder collagen with strong antioxidant activity.

swimming bladder; collagen; peptides; antioxidant activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705026

博士，教授，(本文通訊作者，E-mail: tuzc_mail@aliyun.com)

江西省重大生態安全問題監控協同創新中心資助項目(No,JSX-EW-00)；江西省現代農業產業技術體系建設專項資金資助(No,JXARS-04)

2016-08-16，改回日期：2016-10-08