雙水相萃取法分離純化金針菇子實體多糖

劉景煜，李晨，肖林剛，梁宗鎖，董娟娥*

1(西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌,712100)2(陜西眾興高科生物科技有限公司，陜西 楊凌,712100)

雙水相萃取法分離純化金針菇子實體多糖

劉景煜，李晨1，肖林剛2，梁宗鎖1，董娟娥1*

1(西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌,712100)2(陜西眾興高科生物科技有限公司，陜西 楊凌,712100)

根據雙水相萃取原理，探討了乙醇-硫酸銨雙水相體系對金針菇多糖的分配途徑，并對該體系的雙節線數據進行擬合，確定出擬合度高且參數較少的雙節線方程：y=-5.83-64.76×0.95x，R2=0.999 1。以金針菇多糖萃取率為指標，研究系線長度、硫酸銨質量分數、乙醇質量分數對金針菇多糖的萃取效果。結果表明：在乙醇質量分數為24%、(NH4)2SO4質量分數為21%時，系線長度為47.36，多糖在下相的分配系數為10.57，多糖的萃取率可達92.24%。該法簡單高效，可用于金針菇多糖的分離純化。

金針菇；多糖；雙水相萃取；分離純化

金針菇[Flammulinavelutipes(Curt·Fr) Sing.]為擔子菌目金錢菌屬植物，是一種藥食兩用菌[1]。主要成分有多糖、蛋白、黃酮、多酚及氨基酸等[2-4]。其中，多糖作為主要的有效成分之一，具有抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、提高免疫力[7]等藥理作用。目前，常用水提醇沉、纖維素柱層析等方法分離多糖。但由于存在技術缺陷[8]，現有文獻報道的提取分離條件無法滿足大規模生產的需求。

雙水相體系(aqueous two-phase systems，ATPS)指2種親水性化合物的水溶液在一定質量分數下混合后自發形成的2個不相混溶的水相體系。與常規的溶劑萃取原理類似，即目標物質在兩相間的選擇性分配，可能與分子間氫鍵作用、范德華力、疏水作用、界面性質等因素有關[9]。雙水相萃取是一種新型液-液萃取分離技術，操作簡單、分離效率高、分離條件溫和且工藝容易放大，具備工業化分離天然產物的前景。目前，已有的萃取體系有高聚物-高聚物-水、高聚物-鹽-水、離子液體-鹽-水、小分子有機溶劑-鹽-水等[10～11]，多用于蛋白質、酶、氨基酸、抗生素、黃酮等生物活性物質的萃取[12～16]，有關其在植物多糖萃取中的應用研究較少。

傳統的萃取體系常以高聚物與鹽配合形成，高聚物成本相對較高、難以回收再利用。若以低毒、廉價、易回收的乙醇與鹽配合形成萃取體系，無疑將會降低萃取成本和毒性。因此，本實驗考察利用乙醇-硫酸銨體系萃取分離金針菇多糖的工藝，并對該體系的雙節線數據及液-液相平衡數據進行關聯方程擬合，以此為基礎探討不同系線長度(tie line length，TLL)、乙醇濃度、硫酸銨濃度對金針菇多糖萃取效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇由陜西眾興高科生物科技有限公司提供，50℃烘干至恒重，粉碎過20目篩。

(NH4)2SO4、無水乙醇，成都市科龍化工試劑廠；濃H2SO4，西隴化工有限公司；葡萄糖、蒽酮、3,5-二硝基水楊酸，國藥集團化學試劑有限公司；丙三醇,廣州光華科技股份有限公司；本實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司；電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器有限公司；高速萬能粉碎機，北京中興偉業儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 金針菇多糖提取液的制備

稱取100 g金針菇粉末，加1 000 mL蒸餾水沸水浴煎煮2次(每次30 min)，4層紗布過濾去除粗渣，濾液減壓濃縮至約800 mL，7 000 r/min離心20 min去除沉淀，上清液定容至1 000 mL，4℃儲存備用。

1.3.2 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖的繪制

常溫常壓下，以乙醇為有機相、(NH4)2SO4為無機鹽，采用濁點滴定法[17]繪制相圖：配制一定質量分數的初始(NH4)2SO4水溶液，緩慢滴加無水乙醇，不斷搖勻，直至出現渾濁現象，記錄所滴加乙醇的質量(mei)及體系總質量(mi)；再緩慢滴加蒸餾水，不斷搖勻，至溶液澄清，記錄所滴加蒸餾水質量(mwj)及體系總質量(mj)；反復操作，計算每次渾濁時乙醇及硫酸銨在總體系中的質量分數，如公式(1)和(2)：

(1)

(2)

式中：wi及ws分別為每次渾濁時乙醇及(NH4)2SO4質量分數；mei及mi分別為出現渾濁時所滴加的乙醇質量(g)及體系總質量(g)；ms為體系中硫酸銨質量，mj為體系澄清時體系總質量。

以(NH4)2SO4質量分數為橫坐標，乙醇質量分數為縱坐標作圖，即為該體系的相圖，相圖中的曲線即為雙節線。

1.3.3 液-液相平衡數據的測定

在相圖兩相區選取3個點，將一定質量的乙醇、硫酸鹽及水加入50 mL離心管中，振搖均勻，靜置1 h后7 000 r/min離心10 min使分相完全，上下相中(NH4)2SO4的質量分數用甲醛滴定法測定[18]，乙醇質量分數通過氣相色譜測定[19]，水的質量分數通過質量守恒定律計算得出。雙水相體系的系線長度(TLL)及系線的斜率(S)通過公式(3)(4)計算得到：

(3)

(4)

式中：w1top，w1bot表示乙醇的質量分數；w2top,w2bot表示(NH4)2SO4的質量分數，top表示上相，bot表示下相。

1.3.4 雙節線數據及液-液相平衡數據方程的擬合

應用Origin 9軟件對雙節線數據進行線性多項式擬合及非線性指數擬合，根據現有的經驗方程用Othmer-Tobias方程[20]、Bancroft方程[21]對液-液相平衡數據進行擬合，以相關系數(R2)為指標篩選出擬合度高的雙節線及兩相平衡關聯方程。

1.3.5 多糖質量濃度的檢測

本實驗采用蒽酮-濃硫酸法聯合3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定金針菇多糖含量。蒽酮-濃硫酸法檢測溶液中總糖的質量濃度，DNS法檢測溶液中還原糖的質量濃度。

DNS試劑的配制[22]：精密稱取3,5-二硝基水楊酸3.25g于500 mL容量瓶中，添加少量蒸餾水溶解，加2 mol/LNaOH水溶液162.5 mL，加入丙三醇22.5 g，搖勻，蒸餾水定容，于棕色瓶中4℃儲存備用。

1.3.5.1 標準曲線的繪制

蒽酮-濃硫酸法：稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品1.000 0 g，蒸餾水定容至100 mL，配制成質量濃度為10 mg/mL標準儲備液，精密吸取標準儲備液1 mL，蒸餾水定容至100 mL，配置成質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。分別吸取標準溶液0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL于5 mL比色管中，編號1～7，各加入4.0 mL 0.2%蒽酮-濃硫酸試劑，搖勻冷卻后與沸水浴中加熱5 min，冷卻后用濃H2SO4定容到5 mL，靜置10 min，以1號為空白，于波長620 nm處測其吸光度，以吸光度為橫坐標，葡萄糖標品質量濃度(μg/mL)為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：y=26.433-0.0819，R2=0.999 4，在8.01～20.02 μg/mL內有較好的線性關系。

DNS法：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品100 mg，蒸餾水定容至100 mL，配置成質量濃度為1.0 mg/mL的標準品溶液。吸取標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 mL于10 mL比色管中，分別補加蒸餾水至2 mL，分別添加1.5 mL DNS試劑，混勻后沸水浴5 min，冷卻后定容至10 mL，靜置20 min，編號1～8，以1號為空白，于波長540 nm處測其吸光度，以吸光度為橫坐標，葡萄糖標品質量濃度(mg/mL)為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：y=0.249 3x+0.006 6，R2=0.999 6，在0.02～0.2 mg/mL濃度有較好的線性關系。

1.3.5.2 樣品總糖、還原糖質量濃度的測定

分別取1 mL體系上相十倍稀釋液及下相百倍稀釋液用蒽酮-濃硫酸法測定總糖質量濃度，分別取體系上、下相溶液1 mL用DNS法測還原糖質量濃度

多糖質量濃度/(mg·mL-1)=總糖質量濃度-還原糖質量濃度

(5)

1.3.6 雙水相體系萃取條件的優化

根據乙醇-硫酸銨相圖及液-液相平衡數據方程，考察不同系線長度對金針菇多糖萃取率的影響，并進一步研究乙醇及硫酸銨質量分數對萃取率的影響。

添加一定質量的乙醇、硫酸銨、金針菇提取液及蒸餾水于50 mL離心管中，配置成總質量為30 g的雙水相體系，充分震蕩，靜置1 h后7 000 r/min離心10 min使分相完全，分別測定上下相體積及各相中多糖質量濃度，計算雙水相體系的相比(R)、金針菇多糖分配系數(K)及萃取率，如公式(6)～(8)：

(6)

(7)

(8)

式中：R為體系下、上相的體積比；Vtop和Vbot分別為上下相體積(mL)；K為金針菇多糖在體系中的分配系數；Ctop和Cbot分別為上下相中金針菇多糖的質量濃度(mg/mL)；Y金針菇多糖在下相中的萃取率。

2 結果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖

乙醇-硫酸銨相圖見圖1，其中曲線ADB為體系雙節線，為體系形成的臨界線，單相區不分層，只有所選濃度在兩相區才可分相，所選兩相物質的質量分數為C點時，過C點的線段AB為該點的系線，BC、AC的線段長度比與上下相相比近似等于杠桿定律[23]，

即V上/V下=BC/AC，C點雙水相體系僅有一條系線，該系線上各點為同一系線。一定范圍內，系線越長體系分相能力越強。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system

2.2 雙節線數據方程

對雙節線數據進行關聯，方程、參數及相關系數R2見表1。表1中所列均為篩選出的參數較少且擬合度高的方程，比較R2可見，非線性指數函數更符合該體系雙節線，其中方程1、2、3、4、6擬合度較好，雖然方程1擬合度最高，但是參數較多，因此選擇擬合度高、參數少且簡單的方程6，即y=-5.83-64.76×0.95x為本實驗的雙節線方程，為后續試驗條件的選擇提供基礎。

表1 乙醇-硫酸銨ATPs雙節線關聯方程模型及結果

注：w1、w2分別為乙醇、硫酸銨質量分數，a、b、c、d、e均為方程參數。

2.3 液-液相平衡數據方程

液-液相平衡數據、系線長度及斜率見表2和圖2。可知各體系上下相中乙醇及硫酸銨質量分數坐標點均落在雙節線上，各系線斜率基本一致，因此可根據系線斜率及相圖方程計算試驗組體系中上下相各相的質量分數，進而計算系線長度。利用經驗方程Othmer-Tobias及Bancroft對數據進行關聯，方程及參數見表3，可知2個方程相關性均較高，以lg[(1-w1top)/w1top]對lg[(1-w2bot)/w2bot]作圖，以lg(w3bot/w2bot)對lg(w3top/w1top)作圖，均呈線性關系，說明計算所測系線數據可靠。

表2 體系液-液相平衡數據

圖2 乙醇-硫酸銨雙節線及系線圖Fig.2 Experimentalbinodal and tie line length for ethanol-ammonium sulfate

名稱方程參數knR2Othmer-Tobias方程[(1-w1top)/w1top]=k[(1-w2bot)/w2bot]n0.581.150.9984Bancroft方程(w3bot/w2bot)=k(w3top/w1top)n1.580.820.9953

注：w1、w2、w3分別為乙醇、硫酸銨、水的質量分數。

2.4 系線長度對金針菇多糖萃取率的影響

系線長度對金針菇多糖萃取率的影響見圖3。選取不同系線上的中點，使各體系相比R約為1，此時兩相體積基本相等，一般認為相比為1時萃取效果較好。體系分相后，上相為乙醇相，顏色較深，下相為(NH4)2SO4相，且多糖富集于下相，可能原因為多糖難溶于高濃度乙醇。系線越長體系中兩相的分相能力越強，但隨著系線長度的增加多糖在下相中的分配系數K及萃取率Y呈現出先增大后減少的趨勢，在系線為54.02時達到最大，此時K=11.61、Y=91.46%，體系中乙醇濃度及(NH4)2SO4濃度分別為26.15%、20.85%。可能是因為系線越長下相中(NH4)2SO4的質量分數近飽和，體系中存在乙醇等其他物質與其爭奪水分子，在系線大于54時下相中有(NH4)2SO4析出，(NH4)2SO4的析出降低了下相對多糖的溶解能力，從而使萃取率有所降低。因此有必要在此基礎上，調節乙醇及(NH4)2SO4濃度，進一步優化萃取條件。

圖3 系線長度對金針菇多糖萃取率、相比、分配系數的影響Fig.3 Effect of tie line length on extraction rate, phase ratio, partition co-efficient forpolysaccharides from Flammulina velutipes

2.5 (NH4)2SO4質量分數對金針菇多糖萃取率的影響

固定乙醇質量分數為26%，在系線54.02及雙節線之間選擇7個不同(NH4)2SO4質量分數，考察其對金針菇多糖萃取率的影響，見圖4。在所選擇范圍內，隨著(NH4)2SO4質量分數的增加，多糖萃取率呈現出逐漸增加的趨勢，且在濃度大于20%時增加趨勢減緩。(NH4)2SO4濃度增加，下相中吸引水分子能力增強，使得下相與上相的相比R逐漸增大，但是大于20%時，下相中有(NH4)2SO4過飽和析出，因此固定乙醇質量分數為26%時，選擇(NH4)2SO4質量分數為20%，在此條件下相比R為0.96，分配系數為11.60，萃取率為91.75%。

圖4 (NH4)2SO4質量分數對金針菇多糖萃取率、相比、分配系數的影響Fig 4 Effect of concentrations of ammonium sulfate on extraction rate, phase ratio, partition co-efficient for polysaccharides from Flammulina velutipes

2.6 乙醇質量分數對金針菇多糖萃取率的影響

固定(NH4)2SO4質量分數為21%，在系線54.02及雙節線之間選擇7個不同乙醇質量分數，考察其對金針菇多糖萃取率的影響(見圖5)。隨著乙醇質量分數的增加，多糖萃取率呈現出先增加后減小的趨勢，且在濃度為24%時達到最大，此時相比R為1.13、分配系數為10.57、萃取率可達92.24%。在20%～24%范圍內，隨乙醇質量分數增加，上相吸引水分子能力逐步增加，相比也因此減小，而上相乙醇濃度的增大也使多糖在上相中的溶解度減小，使分配系數增大，從而萃取率達到最大。但是當乙醇濃度進一步增大，乙醇對水分子的吸引能力也進一步增加，使得下相中硫酸銨過飽和析出，體系對多糖萃取效果降低。

綜上所述，選擇乙醇質量分數為24%，(NH4)2SO4質量分數21%為該體系萃取金針菇多糖的條件，此時系線長度為47.36、相比R為1.13、分配系數為10.57、萃取率為92.24%。

圖5 乙醇質量分數對金針菇多糖萃取率、相比、分配系數的影響Fig 5 Effect of concentrations of ethanol on extraction rate, phase ratio, partition co-efficient for polysaccharides from Flammulina velutipes

3 討論

本實驗選取乙醇及(NH4)2SO4作為雙水相萃取體系的成相物質，通過測量各相中乙醇及(NH4)2SO4的質量分數發現兩相中各物質的質量分數坐標點均落在雙節線上，且兩點之間的線段過初始濃度點，說明上下相又各自形成處于臨界狀態的微體系。又因為雙水相體系的上下相之間的相比與BC、AC的線段長度比近似等于杠桿定律(圖1)，所以可以通過相圖、初始質量分數及所構建體系的相比推測體系液-液相平衡數據，比較計算值與實際測量值，發現二者基本一致。

對相圖中的雙節線數據方程進行關聯擬合，有利于更合理地選擇后續萃取條件。目前對乙醇-硫酸銨雙水相體系雙節線數據方程的擬合多套用以往通用的經驗方程[24-25]，針對性較低，且相對標準偏差略大。本實驗利用多種數學非線性指數模型對乙醇-硫酸銨雙水相體系雙節線數據進行關聯擬合，篩選出多種雙節線方程，對該體系專屬性強，擬合度高。

采用響應面法優化雙水相萃取條件可以取得理想的效果[26]，但選擇合適的兩相質量分數較困難，所需實驗也較多。本實驗首先考察系線長度(即分相能力)對萃取效果的影響，確定出萃取效果較好的各相質量分數。進一步調整(NH4)2SO4及乙醇質量分數，優化萃取條件，取得了理想的效果。

對于多糖含量的檢測用蒽酮-濃硫酸法、苯酚-濃硫酸法[27]，測量值為樣品中總糖的含量，常使結果偏大，影響準確性。本實驗選擇蒽酮-濃硫酸法聯合DNS法測量多糖，排除了還原糖對測量結果的影響。實驗發現，系線長度較小時，還原糖基本分布于上相，下相中含量極小。隨著系線的增加，上相中的還原糖分配量也逐漸減少，下相中分配量保持不變，推測還原糖分布于中間雜質層。產生這種現象的原因有待進一步研究。

本實驗對下相進行透析處理，去除下相中(NH4)2SO4，減壓濃縮到一定程度后冷凍干燥，得到金針菇多糖，經檢測所得金針菇多糖純度為56.3%，遠高于乙醇沉淀法所得的金針菇多糖純度(19.4%)。金針菇中含有大量的蛋白等物質，使提取液顏色較深且渾濁。利用雙水相萃取法在分離金針菇多糖時，乙醇相顏色較深，溶解了部分有色雜質。萃取體系分相且離心后，兩相澄清，在兩相中間有一層不溶物，呈白色膠絮狀(非乳化層)。綜上所述，雙水相萃取法對金針菇多糖有較好的純化作用，同時也可以去除還原糖、色素等雜質。

4 結論

本實驗探討了乙醇-硫酸銨雙水相體系對金針菇多糖的分配效果，并對雙節線方程進行擬合，確定出擬合度高且參數較少的非線性指數方程：y=-5.83-64.76×0.95x為本實驗的雙節線方程。在乙醇質量分數為24%、(NH4)2SO4質量分數為21%時系線長度為47.36、分配系數為10.57的條件下，金針菇多糖萃取率可達92.24%。

利用雙水相法萃取金針菇多糖時，多糖富集于下相硫酸銨水溶液中，該體系具有較好的除色素、除還原糖作用，且操作簡便、試劑低毒廉價、目標產物易回收、適宜于大規模生產，具有較大的應用價值。

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Isolation and purification of aqueous two-phase extraction of polysaccharides fromFlammulinavelutipes

LIU Jing-yu1, LI Chen1，XIAO Lin-gang2, LIANG Zong-suo1, DONG Juan-e1*

1(College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)2 (Shaanxi zhongxing high-tech biological technology Co. LTD, Yangling 712100, China)

Abstract: This study investigated the effect of ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system on the extraction and purification of polysaccharides fromFlammulinavelutipesbased on two aquous phase extraction. The experimental date of this system was simulated and the math model was established asy=-5.83-64.76×0.95x，R2=0.999 1. The effect of tie line length(TLL), concentrations of ethanol and ammonium sulfate on the extraction yield of polysaccharides fromFlammulinavelutipeswas studied. The results showed the partition coefficient in lower phase and extraction yield of polysaccharides were 10.57 and 92.24%, respectively. The results showed that TLL was 47.36 when ethanol was 24% and (NH4)2SO4was 21%. This method is simple and efficient and can be used for the isolation and purification of polysaccharides fromFlammulinavelutipes.

Flammulinavelutipes; polysaccharides; aqueous two-phase extraction; extraction and purification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705041

碩士(董娟娥教授為通訊作者，E-mail: dzsys@nwsuaf.edu.cn)。

陜西省科技統籌創新工程計劃(No. 2015KTTSNY03-07)

2016-08-11，改回日期：2016-10-30