氧化鋯/聚亞甲基藍修飾電極檢測CaMV35S啟動子基因

張 娜 徐基貴* 談勝福 汪 麗 張克營 王 聰 楊柳青

(1 宿州學院 化學化工學院,安徽 宿州 234000；2 宿州學院 體育學院，安徽 宿州 234000)

氧化鋯/聚亞甲基藍修飾電極檢測CaMV35S啟動子基因

張 娜1徐基貴1*談勝福1汪 麗1張克營1王 聰1楊柳青2

(1 宿州學院 化學化工學院,安徽 宿州 234000；2 宿州學院 體育學院，安徽 宿州 234000)

制備了基于氧化鋯(ZrO2)/聚亞甲基藍(PMB)修飾電極的無標記DNA傳感器，用于轉基因植物CaMV35S啟動子基因的檢測。探針DNA(ssDNA)通過ZrO2和DNA的磷酸基的相互作用修飾到電極表面，以PMB氧化峰的示差脈沖伏安響應為檢測信號，傳感器和完全互補的DNA片段雜交后，PMB的氧化峰電流明顯降低，當和完全不匹配的DNA片段雜交時，峰電流無明顯變化。對于完全互補的DNA片段，在2.0×10-12～2.0×10-8mol/L濃度范圍內峰電流的變化值和濃度的對數成良好的線性關系，檢測限為4.1×10-13mol/L(S/N=3)。所制備的傳感器具有良好的穩定性、再生性和重現性，用于樣品檢測，結果令人滿意。

聚亞甲基藍；氧化鋯；DNA傳感器；無標記

前言

轉基因食品是近些年興起的一類食品，轉基因從一開始就引起了學界的普遍關注，轉基因食品的研究對于人們的日常生活具有重要意義。脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質信息的承擔者，具有儲存和傳遞遺傳信息的功能。轉基因食品的DNA片段中核苷酸堿基的特定序列決定了基因的遺傳特性，對DNA結構的研究、特定DNA片段堿基排列順序的研究，以及DNA的突變研究對食品衛生檢驗和藥物篩選等方面具有十分重要的意義。利用核酸分子雜交技術檢測特定DNA序列已經成為一個研究熱點[1-2]。

電化學DNA傳感器是近年來興起的一種非常優良的生物傳感器，能夠用于檢測基因及一些能與DNA發生特殊相互作用的物質[3-7]。聚合物以其優良的導電性能成為良好的電極修飾材料[8]，在傳感器中應用十分廣泛。更重要是導電聚合物對修飾電極界面性質的改變具有極高的敏感性[9]，研究表明特定序列的DNA在電極表面雜交前后會使導電聚合物的電化學信號發生改變[10]。亞甲基藍(methylene blue, MB)作為一種電子媒介體，其在電極上的性能比較活潑，具有良好的電化學行為，基于電聚合方法制備的PMB修飾電極對一些生物分子具有良好的催化作用[11-13]。ZrO2是一種良好的半導體材料[14-15]，研究證明其能夠和DNA的磷酸基團發生強的作用，能夠為DNA在電極表面的固定提供平臺[16]。

本文制備了基于ZrO2/PMB的無標記電化學DNA生物傳感器，研究了該修飾電極在檢測轉基因植物CaMV35S啟動子基因中的應用[17]，實驗結果顯示所制備的傳感器具有較好的選擇性和靈敏性，進而構建了檢測新型的轉基因植物CaMV35S啟動子基因的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學工作站CHI660D型(上海辰華儀器公司)，電化學測定使用三電極體系：裸玻碳電極和修飾電極作為工作電極，鉑電極作為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極。TG16離心機(湖南英泰儀器有限公司)，KQ5200DB型號數控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

所使用的DNA序列分別為：

探針DNA：5′-TCT TTG GGA CCA CTG TCG-3′；

完全互補DNA：5′-CGA CAG TGG TCC CAA AGA-3′；

完全錯配DNA：5′- GCT TCC ATC GAG ATC GTC-3′。

磷酸緩沖鹽溶液PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)：采用磷酸氫鈉和磷酸二氫鈉混合配制溶液,用H3PO4和NaOH調節溶液的pH值。

DNA雜交溶液：含氯化鈉(0.1 mol/L)的PBS(0.1 mol/L)，pH=7.0)。

用N2除去溶液中的氧,實驗所需用水均為二次蒸餾水。

1.2 ssDNA/ZrO2/PMB/GCE的制備

把裸的玻碳電極使用1.0、0.3及0.05 μm Al2O3粉末打磨拋光，依次用無水乙醇、水超聲清洗1 min后，晾干。把已經處理的玻碳電極置于含有MB(3 mmol/L)的PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)中，在-0.6～ 0.6 V的電位范圍內以100 mV/s的掃描速率循環伏安掃描20周，用水淋洗，制備的電極稱為PMB/GCE。然后將該電極置于含KCl(0.1 mol/L)的氧氯化鋯(5 mmol/L)溶液中，在-1.1～0.7 mV的電位窗口內以100 mV/s的掃描速率循環伏安掃描10周，用二次蒸餾水淋洗晾干，制備的電極稱ZrO2/PMB/GCE。

取10 μL ssDNA(1.0×10-5mol/L)溶液滴涂到處理好的電極表面，在4 ℃的冰箱中保存12 h，依次用pH=7.0的PBS，水淋洗，去除多余的未固定ssDNA, 制備的電極稱ssDNA/ZrO2/PMB/GCE。

1.3 實驗方法

實驗使用CHI660D電化學工作站記錄電流響應信號。三電極系統分別是：以修飾電極為工作電極，SCE為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。支持電解質為PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)。PMB的氧化峰電流在DNA雜交前后的變化ΔI作為DNA雜交檢測信號：△I=IdsDNA-IssDNA

IdsDNA—雜交后PMB的氧化峰電流；IssDNA—雜交前的PMB的氧化峰電流。

2 結果與討論

2.1 ZrO2/PMB/GCE的電化學表征

圖1是不同電極在PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)和Fe(CN)63-/4-(5 mmol/L)溶液中的電化學阻抗圖(實驗電壓0.19 V)。裸GCE(a)，PMB/GCE(b),ZrO2/PMB/GCE(c), ssDNA/ZrO2/PMB/GCE(d)。當MB聚合到裸玻碳電極表面時，電極呈現良好的導電性，電極阻抗圖相當于一條直線(b)。當氧化鋯電沉積到PMB修飾電極的表面時，電子傳遞阻力變大(c)，這可能是由于ZrO2是半導體的緣故。當ssDNA組裝到電極表面后，如圖1(d)所示，其電阻傳遞阻力變大，這可能是因為DNA的磷酸基的負電和Fe(CN)63-/4-之間排斥作用的原因，表明修飾電極已經成功制備。

圖1 不同電極的阻抗圖Figure 1 Impedance plots for different electrodes.

2.2 掃描速率的影響

研究了掃描速率對ZrO2/PMB/GCE 的CV響應的影響，結果如圖2所示。在50～350 mV/s掃描速率范圍內，PMB的氧化峰的峰電流和還原峰的峰電流隨掃速的增加，均呈良好的線性關系，它們的線性方程各自為i=1.029 6+3.508 6v，i=-1.877 4-3.020 0v，相關系數分別為R=0.990 2，R=0.991。表明該電極反應過程為吸附控制。

圖2 掃描速率對ZrO2/PMB/GCE的CV響應的影響Figure 2 Effects of scan rates on the CV of ZrO2/PMB/GCE responses.

2.3 雜交溫度的優化

DNA的雜交溫度影響傳感器的檢測靈敏性，對DNA的雜交溫度進行了優化。圖3所示，隨著溫度的升高，△I不斷增加，當超過50 ℃時，△I不再增強且有下降趨勢。因此，實驗選擇50 ℃為最佳溫度。

圖3 雜交溫度對△I的影響Figure 3 Effects of hybridization temperatures on △I.

2.4 雜交時間的優化

雜交時間的優化實驗表明(圖4)：在雜交時間為5～20 min內，△I隨著雜交時間的增加而增加。當雜交時間超過20 min時，△I不再增加而趨于穩定，說明DNA的雜交達到飽和。因此，在實驗中20 min為最佳雜交時間。

圖4 雜交溫度對△I的影響Figure 4 Effects of hybridization times on △I.

2.5 傳感器的選擇性

圖5是ssDNA/ZrO2/PMB/GCE與不同序列的目標DNA(10-6mol/L)雜交后的差分脈沖伏安圖。由圖5可知：當其與完全互補DNA序列雜交后峰電流變化最大(c)，而與完全錯配的DNA序列雜交時，峰電流基本沒有變化。說明該傳感器能夠區分互補和錯配的DNA序列。

圖5 傳感器與不同序列的目標DNA雜交后的差分脈沖伏安圖Figure 5 The DPV plots for the sensors hybridized with different DNAs

2.6 傳感器的線性范圍

圖6為△I與完全匹配DNA濃度對數之間的關系。對堿基完全互補但濃度不同的目標DNA進行雜交檢測，實驗結果顯示：隨著完全匹配DNA濃度的不斷增加，而產生的峰電流依次減小。目標DNA的濃度(2.0×10-8、2.0×10-9、2.0×10-10、2.0×10-11、2.0×10-12mol/L)在2.0×10-12～2.0×10-8mol/L范圍內，△I與完全互補DNA濃度的對數呈良好的線性關系。線性方程為ΔI=10.61+0.76 log[cDNA],相關系數R=0.9769，檢測限約為4.1×10-13mol/L(S/N=3)。

2.7 傳感器的穩定性、重現性和再生性

把修飾電極放在PBS(pH 7.0)中置于冰箱內保持4 ℃，分別放置不同時間(3、5、7 d)后，用于同濃度完全匹配的DNA檢測，與新制備的傳感器比較，檢測信號分別為原來的92.4%，89.6%，86.8%。實驗結果表明傳感器的穩定性較好。同時制備4支傳感器，進行完全匹配同濃度的DNA檢測，相對標準偏差是4.5%，結果表明該傳感器有好的重現性。把已經雜交的傳感器放在濃氫氧化鈉溶液中10 min后，依次用二次水、pH值為7.0的PBS淋洗后浸泡1 min，而后用于相同濃度完全匹配的DNA檢測，連續4次，檢測信號能保持為第1次的97.2%，92.5%，89.7%。實驗結果表明所制備的傳感器可以通過堿變性而實現再生。

2.8 樣品測定

實驗中把綠色蔬菜葉汁作為干擾物質研究所制備傳感器的實際應用。取定量綠色蔬菜葉用二次蒸餾水清洗后，放入榨汁機中進行處理，取定量綠色蔬菜葉汁放在離心機中以10 000 r/min的速度離心5 min，取處理后的綠色蔬菜葉汁0.5 mL放在1.5 mL的雜交溶液中，加入完全匹配的目標DNA進行回收率實驗，實驗結果如表1。實驗結果表明該傳感器可以用于實際樣品測定，具有較好的實際應用價值。

表1 樣品分析結果

3 結論

本文研制了基于ZrO2/PMB/GCE的電化學DNA生物傳感器，優化了實驗條件，研究了傳感器在轉基因植物CaMV35S啟動子基因檢測中的應用。同時，制備的傳感器具有較高的靈敏性，能夠區分不同序列的DNA片段。此外，該傳感器性能較為穩定，具有良好的選擇性和再生性。其在DNA分析中具有潛在的應用價值。

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Preparation of Label-free Electrochemical CaMV35S Transgene Gene Sensor Based on ZrO2/Poly(methelene blue) Modified Electrode

ZHANG Na1, XU Jigui1*, TAN Shengfu1, WANG Li1, ZHANG Keying1, WANG Cong1, YANG Liuqing2

(1.DepartmentofChemistryChemicalEngineering,SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China；2.DepartmentofPhysicalEducation,SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China)

A ZrO2/poly(methelene blue) modified electrode was fabricated as a label-free DNA sensor used for CaMV35S transgene gene detection. Probe oligonucleotides (ssDNA) were immobilized on the ZrO2thin films via the strong affinity between ZrO2and phosphate groups. The changes of peak current of poly(methelene blue) were used as the detection signal.It was found that when the sensor hybridized with complementary target ssDNA, an obvious decrease of PMB oxidation peak currents was observed, whereas no obvious change of PMB oxidation peak currents was observed when the probe hybridized with non-complementary target ssDNA.For the completely complementary target ssDNA sequence, in the concentration range of 2.0×10-12—2.0×10-8mol/L,the change of peak current has a good linear relationship with the logarithm of the concentration of complementary target ssDNAwith thethe detection limit of 4.1×10-13mol/L (S/N=3).In addition, the sensor also exhibited an excellent stability, reproducibilityand repeatibility. Itwas applied to determine CaMV35S transgene gene sequencewith satisfactory results.

poly(methelene blue);ZrO2; DNA biosensor; label-free

10.3969/j.issn.2095-1035.2017.02.019

2016-10-08

2017-01-25

安徽省高校自然科學基金項目(KJ2017AA4341)；宿州學院優秀青年人才支持項目(SZXYQNL2017001)；宿州學院科研平臺開放課題(2011YKF03，2015YKF16)；國家大學生創新創業項目(201510379037)；省級大學生創新創業訓練項目(201510379051)；宿州學院大學生科研立項(KYLXLKYB16-04)資助

張娜，女，講師，主要從事電分析化學研究。

*通信作者：徐基貴，男，教授，主要從事化學研究。E-mail：szxyzn@163.com

O657.15；TH832.4

A

2095-1035(2017)02-0078-05

本文引用格式：張娜,徐基貴,談勝福,等.氧化鋯/聚亞甲基藍修飾電極檢測CaMV35S啟動子基因[J].中國無機分析化學,2017,7(2):78-82.

ZHANG Na,XU Jigui, TAN Shengfu, et al. Preparation of Label-free Electrochemical CaMV35S Transgene Gene Sensor Based on ZrO2/poly(methelene blue) Modified Electrode[J].Chinese Journal of Inorganic Analytical Chemistry,2017,7(2):78-82.