產(chǎn)殼聚糖酶土壤微生物的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

毛貴珠++章曄敏++邵一凡++熊妍妍++陳小娥++方旭波

摘要：對浙江舟山蝦蟹養(yǎng)殖場附近的土壤進行針對性地采樣，通過殼聚糖平板初篩、搖瓶復篩獲得一株具有產(chǎn)殼聚糖酶活性的菌株，編號為ZJOU-AC1。通過形態(tài)觀察、ITS全序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建，確定ZJOU-AC1為鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus）。對其產(chǎn)酶條件進行初步優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為膠體殼聚糖1.5%，（NH4）2SO4 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%。最適發(fā)酵周期為96 h。ZJOU-AC1產(chǎn)酶活力由2.05 U/mL提高到4.85 U/mL，與優(yōu)化前相比提高了2.36倍。

關鍵詞：殼聚糖酶，土壤，菌株篩選，菌株鑒定，發(fā)酵條件，優(yōu)化

中圖分類號：TQ925 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1913-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.029

Screening and Identification of Chitosanase-producing Microorganisms from Soil and Optimization of the Fermentation Conditions

MAO Gui-zhua，ZHANG Ye-mina，SHAO Yi-fana，XIONG Yan-yana，CHEN Xiao-ea，F(xiàn)ANG Xu-boa，b

（a.College of Food and Medicine；b.State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang， China）

Abstract： In order to screen desirable strains， we take sample of soil from areas adjacent to manufacturing locations of those plants which culture shrimps and crabs in Zhoushan. In this study，we had isolated a high Chitosanase-producing fungus ZJOU-AC1 from the soil by primary screening of plate specula and shaking cultivation. Based on standard morphological，physiological properties，ITS rDNA sequence and the construction of phylogenetic tree，the fungus ZJOU-AC1 was identified as Aspergillus cervinus. We also optimized the fermentation conditions to increase its productivity of chitosanase. The optimum medium components for chitosanase production by fungus ZJOU-AC1 were determined and listed as follows：colloid chitosan 1.5%，（NH4）2SO4 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%. The optimum fermentation period is 96 h. The maximal chitosanase activity could reach 4.85 U/mL when ZJOU-AC1 was incubated in flask under the optimum cultural conditions. The activity increased by 2.36 times in comparison with initial activity of 2.05 U/mL.

Key words：chitosanase；soil；strain screening；strain identification；fermentation condition；optimization

殼聚糖是甲殼素脫N-乙酰基的產(chǎn)物，在自然界中儲量豐富，具有安全、無毒、抑菌、成膜、可降解、可食用等多種特性[1]，但其分子量大，晶體結構緊密，水溶性差，在開發(fā)應用上存在一定局限性[2]。根據(jù)已有文獻報道，通過降解殼聚糖可得聚合度在20以下的殼寡糖，其水溶性好且易被吸收。由于具備獨特的功能性質(zhì)，殼寡糖在廢水處理、食品工業(yè)、日用化學品、紡織、化工、農(nóng)業(yè)、生物工程和醫(yī)藥等方面均具有廣泛的應用前景[3-5]。

殼聚糖的水解方式一般有化學法、物理法和生物酶法，其中，生物酶法是利用非專一或專一性酶對殼聚糖進行降解產(chǎn)生殼寡糖的方法，具有反應過程容易控制、專一性高和反應條件溫和等優(yōu)點。雖然已報道有30多種非專一性酶能降解殼聚糖[6]，但這些商品酶制劑的水解效率并不高，也尚未被證實是否含殼聚糖酶（EC3.2.1.132）。殼聚糖酶是一種專一性水解酶，是酶法降解殼聚糖研究的重要內(nèi)容[7]。同時，從自然環(huán)境中尋找到產(chǎn)殼聚糖酶的新菌株也是殼聚糖應用研究的關鍵內(nèi)容[8]。

本研究目的是首先從浙江省舟山市毗鄰的常年養(yǎng)殖蝦蟹的養(yǎng)殖場附近的山坡及海域篩選殼聚糖酶產(chǎn)生菌株，在此基礎上，通過復篩確定產(chǎn)酶能力較強的菌株，并進一步通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高其產(chǎn)酶能力，以期獲得較好的殼聚糖酶產(chǎn)生菌株，為酶法降解殼聚糖的研究提供高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 樣品采集于浙江省舟山市定海區(qū)五雷山及浙江省舟山市沈家門水產(chǎn)加工廠旁的海灘。在采樣地區(qū)分別確定5個采樣點，在確定的采樣點上，先用土鏟去除表層5 cm左右的土壤，然后傾斜向下去除片狀土壤，將各采樣點土壤集中在一起混合均勻，各取50 g左右裝入無菌袋中帶回。

1.1.2 試劑 殼聚糖由浙江普陀新興藥業(yè)有限公司提供，脫乙酰度≥90%；膠體殼聚糖為實驗室自制，參考孫玉英等[9]研究；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 恒溫生化培養(yǎng)箱SPX-250B型（上海福瑪實驗設備有限公司）；雙人凈化工作臺SW-CJ-2D型（蘇州凈化設備有限公司）；自動高壓滅菌鍋 LMQ—R3260（上海昨非實驗室設備有限公司）；UV-6000紫外分光光度計（蘇州江東精密儀器有限公司）；HHS電熱恒溫水浴鍋（上海棱光技術有限公司）；BS110電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；光學顯微鏡（Leica DM500）；冷凍離心機（Thermo LEGEND MICRO 17R）。

1.1.4 培養(yǎng)基 斜面保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）；初篩培養(yǎng)基（膠體殼聚糖平板）：A液為1%膠體殼聚糖（1%的醋酸溶解，調(diào)節(jié)pH至5.5～5.8），B液為酵母粉0.1%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%；液體培養(yǎng)基（復篩液體培養(yǎng)基）：膠體殼聚糖1%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 5.5；種子培養(yǎng)基：膠體殼聚糖0.2%，葡萄糖1%，KH2PO4 0.2%，（NH4）2SO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，自然pH。以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min，其中A、B液分開滅菌后再等體積混合。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株的分離 每份樣品取土樣10 g置于100 mL含有無菌生理鹽水的三角瓶（6顆玻璃珠）中，在150 r/min，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)30 min。將土壤樣品混合液進行梯度稀釋，得到10-1～10-5稀釋度的土壤稀釋液。分別取1 mL涂布于膠體殼聚糖平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。挑選具有殼聚糖水解透明圈的菌落于另一膠體殼聚糖平板上劃線純化，于30 ℃烘箱中經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)2～3 d后移入4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選與純化 ①平板透明圈初篩與確認。將分離得到的菌株在膠體殼聚糖平板上平行劃線，倒平板時注意控制各平板的厚度大致相同，30 ℃培養(yǎng)5～6 d。每天測量并記錄各菌落的直徑（d）以及各菌落周圍的透明圈直徑（D），以d值和D/d值大小為指標挑選降解殼聚糖能力較強的菌株，選擇透明圈與菌落直徑比較大的菌株作為進一步復篩的出發(fā)菌株。②產(chǎn)酶菌株的純化。通過劃線分離以達到純化培養(yǎng)的目的，即選取在膠體殼聚糖平板上形成的透明圈直徑與菌落直徑比較大的菌落，對其進行多次劃線純化培養(yǎng)，然后挑取單菌落接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃烘箱中培養(yǎng)3～4 d，后移入 4 ℃冰箱中保存，備用。③菌株的復篩。從PDA斜面培養(yǎng)基中刮取一菌環(huán)接入種子培養(yǎng)基中（裝液量75 mL/250 mL三角瓶），在30 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d。將種子培養(yǎng)中得到的各菌株分別以1/15 mL培養(yǎng)基的量接種到復篩液體培養(yǎng)基中（裝液量75 mL/250 mL三角瓶），于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，每隔12 h測定一次發(fā)酵液的酶活力。將離心后的發(fā)酵液上清液稀釋100倍測定酶活，酶活測定方法為3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[10]。最終綜合考慮酶活及產(chǎn)酶菌株初篩結果，選擇高產(chǎn)殼聚糖酶菌株。

1.2.3 菌種鑒定 ①形態(tài)學觀察。將優(yōu)勢菌株劃線于膠體殼聚糖平板中，30 ℃培養(yǎng)5～6 d以獲得細菌的單菌落，利用光學顯微鏡和菌體染色制片對菌株進行形態(tài)特征觀察并拍照。同時，依據(jù)魏景超[11]的《真菌鑒定手冊》對菌種進行初步鑒定。②ITS全序列分析。菌株的ITS序列鑒定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成[12]。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化研究 單因素試驗：①碳源對產(chǎn)酶的影響。在液體培養(yǎng)基中，分別以葡萄糖、乳糖、淀粉、氨基葡萄糖以及乙酰氨基葡萄糖代替復篩液體培養(yǎng)基中的膠體殼聚糖作為碳源（碳源濃度為1%），考察不同碳源對產(chǎn)酶的影響。在此基礎上改變碳源濃度，分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察不同濃度的碳源對產(chǎn)酶的影響。②氮源對產(chǎn)酶的影響。在液體培養(yǎng)基中，分別以牛肉膏、硝酸鈉、蛋白胨、氯化銨、酵母粉代替復篩液體培養(yǎng)基中的硫酸銨（氮源濃度為0.2%），考察不同氮源對產(chǎn)酶的影響。在此基礎上，固定碳源濃度，改變氮源濃度，分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%，考察不同濃度的氮源對產(chǎn)酶的影響。數(shù)據(jù)分析：每個試驗點取3組平行樣，最終的測量值取平均值[13]，3組平行樣的誤差控制在5%以內(nèi)。

2 結果與分析

2.1 菌株初篩結果

從采集的土樣篩選到13株有產(chǎn)酶能力的菌株，經(jīng)過進一步篩選、分離和純化，挑取菌落周圍產(chǎn)生明顯的水解透明圈，并且水解圈直徑和菌落直徑的比值（D/d）較大的6株，編號分別為ZJOU-AC1、ZJOU-AC2、ZJOU-AC3、ZJOU-AC4、ZJOU-AC5和ZJOU-AC6（表1）。

2.2 菌株復篩

根據(jù)菌株在膠體殼聚糖平板上產(chǎn)生透明圈直徑和菌落直徑的比值（D/d）大小進行初步篩選是可行的，但透明圈的大小并不能完全反映菌株的產(chǎn)酶能力，因為菌落周圍透明圈的大小除了與產(chǎn)酶能力有關，還與菌株本身產(chǎn)生的殼聚糖酶的種類有關[6]。因此，通過搖瓶復篩來達到精選的目的。將已純化的具有較強產(chǎn)殼聚糖酶能力的6株菌進行搖瓶復篩，測每株菌株0～7 d的最高酶活力（表2）。

由圖1可以看出，菌株ZJOU-AC1最高酶活力達2.05 U/mL，為產(chǎn)酶活力最高的菌株，也是初篩中透明圈直徑與菌落直徑比值最大的菌株。綜合考慮兩者結果，將ZJOU-AC1作為進一步研究的試驗菌株。

2.3 菌株ZJOU-AC1鑒定

2.3.1 菌株ZJOU-AC1的形態(tài)觀察及鏡檢 菌株ZJOU-AC1的菌落特征：菌株在膠體殼聚糖平板以及PDA培養(yǎng)基上均能良好生長。菌株在膠體殼聚糖平板上的菌落直徑為5.5～6.5 mm，米白色，表面粗糙、隆起、呈饅頭形、絮狀、結構疏松且邊緣整齊；在PDA培養(yǎng)基上，菌落生長前期呈米白色，后期微黃且不透明。菌株ZJOU-AC1的顯微鏡形態(tài)特征：較多分支的有隔菌絲及其頂端的孢子和孢子囊，子囊殼有包被，無孔口，分生孢子串生。參照魏景超[11]的研究，菌株ZJOU-AC1與曲霉（Aspergillus）的形態(tài)特征描述基本一致。

2.3.2 ITS rDNA序列克隆結果 PCR擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，獲得1條約600 bp大小的特異DNA帶（圖3），基因組DNA的條帶清晰，無降解。

2.3.3 ITS全序列分析 真菌核糖體基因包括4種，分別為28S rDNA，5S rDNA，18S rDNA和5.8S rDNA，相互之間由間隔區(qū)（Internal Transcribed Space，ITS）分隔。真菌的ITS序列包括ITS1和ITS2兩部分，其進化速度快，具有多態(tài)性，適用于對親緣關系較近的菌株進行區(qū)分鑒定。

將菌株ZJOU-AC1進行36次純化培養(yǎng)的單菌落進行ITS序列測定，將菌株ZJOU-AC1的ITS基因序列在NCBI官網(wǎng)中使用Nucleotide BLAST比對，選取該菌種使用MEGA構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。由圖4可知，菌株ZJOU-AC1的ITS序列與Aspergillus cervinus的同源性達到99%以上。結合菌株形態(tài)觀察、顯微特征以及ITS同源性分析，鑒定菌株ZJOU-AC1為鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus）。

2.4 菌株ZJOU-AC1的產(chǎn)酶曲線

將菌株ZJOU-AC1接種到液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)0～7 d，每隔12 h測定酶活一次。

由圖5可知，前24 h產(chǎn)酶量極低，自24～96 h產(chǎn)酶量迅速增長，到96 h為最大產(chǎn)酶量，其酶活力達2.05 U/mL，自96～120 h，產(chǎn)酶量幾乎保持恒定，120 h之后緩慢減弱。

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.5.1 碳源對產(chǎn)酶的影響 由表3可知，在濃度均為1%的葡萄糖、乳糖、淀粉、膠體殼聚糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖6種碳源中，最適合菌株ZJOU-AC1產(chǎn)酶的是膠體殼聚糖，以葡萄糖、乳糖、淀粉等作為碳源時，菌株ZJOU-AC1產(chǎn)酶效果相對較差。由圖6可知，酶活最高時對應的膠體殼聚糖濃度為1.5%，此時測得菌株ZJOU-AC1酶活為3.28 U/mL，故1.5%為最適碳源濃度。

2.5.2 氮源對產(chǎn)酶的影響 由表4可知，在硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、氯化銨、酵母粉、蛋白胨6種不同氮源中，硫酸銨和酵母粉的效果較好。但兩者所對應酶活大小相差甚小，綜合經(jīng)濟成本考慮，選擇硫酸銨為該菌株產(chǎn)酶的最適氮源。由圖7可知，硫酸銨濃度達到0.4%時，酶活可達4.85 U/mL，故0.4%為最適氮源濃度。

3 小結與討論

國內(nèi)外相關研究表明，殼聚糖有抗菌抑菌、抗腫瘤等功效[13，14]。由降解殼聚糖加工制成的殼寡糖產(chǎn)品在國外已廣泛應用于生物醫(yī)藥、保健食品、農(nóng)林畜牧等領域[15，16]，但中國尚無商品化殼寡糖的產(chǎn)品的問世。因此，篩選具有高效產(chǎn)殼聚糖酶能力的菌株并進一步優(yōu)化其產(chǎn)酶條件顯得至關重要。

浙江舟山是海洋大省，也是水產(chǎn)加工大省，每年均有大量甲殼素資源無法合理利用，這些甲殼素資源往往堆積在各海域海灘或一些常年養(yǎng)殖蝦蟹的廠家生產(chǎn)場地附近。由于海洋中蘊含的甲殼素資源極其豐富，因此，在長期的能量代謝、循環(huán)利用以及生物進化過程中，必然會產(chǎn)生很多獨特的降解殼聚糖的菌種，這些菌種分布在海域海灘及山坡的可能性較大[7]。因此，本研究從海灘以及一些毗鄰常年養(yǎng)殖蝦蟹的廠家生產(chǎn)場地附近的山坡采樣。

本研究以膠體殼聚糖為碳源才能誘導菌株ZJOU-AC1高效產(chǎn)酶，在此條件下測得菌株ZJOU-AC1酶活遠遠高于以葡萄糖、乳糖、淀粉等作為碳源時所測得的酶活，說明該菌為較專一的殼聚糖酶降解菌，且其所產(chǎn)殼聚糖酶為誘導酶，這與康立新等[17]的報道基本一致。

已報道的能產(chǎn)殼聚糖酶的微生物種類較多，包括細菌（Bacillus[18]、Pseudomonas[19]、Arthrobacter[20]、Sphingomon[21]），放線菌（Keratanolyticum[22]），霉菌（Penicillium[23]、 Aspergillus[24]）等，但其中能高效產(chǎn)殼聚糖酶的菌株較少。如閻賀靜等[25]在其研究中篩選所得煙曲霉（Aspergillus fumigatus）經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后最高酶活力為3.1 U/mL，尹愛國等[2]在其研究中篩選所得菌株經(jīng)發(fā)酵條件初步優(yōu)化后酶活為0.272 U/mL。本研究篩選所得的鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus），經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，酶活力從最初的2.05 U/mL提高到4.85 U/mL，達優(yōu)化前的2.36倍。由于目前國內(nèi)尚無該菌的相關報道，因此，該菌株是高產(chǎn)殼聚糖酶的一個新菌種，可為高產(chǎn)菌株酶法降解殼聚糖的加工應用提供基礎。

參考文獻：

[1] AN J，BIY Y，YANG CX， et al. Electrochemical study and application on rutin at chitosan/graphene films modified glassy carbon electrode[J].Journal of Pharmaceutical Analysis，2013（2）：102-108.

[2] 尹愛國，郭春科，龍 帥.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件研究[J].甘肅科學學報，2012（4）：45-48.

[3] 劉 杰，許 晶，王能飛.一株高產(chǎn)殼聚糖酶細菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2014，53（3）：517-521.

[4] 狄文偉.殼寡糖在蔬菜生產(chǎn)上的應用[J].北方園藝，2016（8）：54-55.

[5] 羅泉清，高海琪，陳 媛，等.殼寡糖修飾的納米銀作為抗菌材料的合成與制備[J].高分子材料科學與工程，2016，32（2）：13-18.

[6] 陳小娥.曲霉產(chǎn)殼聚糖酶酶學性質(zhì)及作用機理研究[D].江蘇無錫：江南大學，2004.

[7] 戴秋萍，方和娣，陶 詩，等.二株產(chǎn)殼聚糖酶海洋微生物的篩選和鑒定[J].海洋環(huán)境科學，2012，31（3）：385-390.

[8] 戴 蕓，朱旭芬.微生物殼聚糖酶的研究概況[J].浙江大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2004，30（2）：114-121.

[9] 孫玉英，張繼泉，王淑軍.殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件的研究[J].食品科學，2009，30（15）：164-168.

[10] 聶 明，魏新林，萬佳蓉，等.土壤中選育產(chǎn)殼聚糖酶菌株的研究[J].生物技術，2005，15（5）：16-18.

[11] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[12] 蔡婉玲，田寶玉，郭 菁，等.蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選和紫外誘變育種[J].生物技術，2011，21（1）：73-76.

[13] 曹秀明.殼寡糖及衍生物抗腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)作用及其機制的研究[D].山東青島：中國海洋大學，2010.

[14] 陳紅霞.殼寡糖增強免疫及抗腫瘤活性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2013.

[15] SUYG，DUYZ，YUAN H，et al. Redox-sensitive polymer-drug conjugate of doxorubicin conjugated stearic acid-g-chitosan oligosaccharide polymeric micelles for cancer therapy[A]. Chinese Pharmaceutical Association（CPA）[C].Beijing：Chinese Pharmaceutical Association（CPA），2013.

[16] HUANG G Q，SIN J P，WANG D F，et al. Chitosan oligosaccharide-Ca complex accelerates the depuration of cadmium from chlamys ferrari[J]. Journal of Ocean University of China， 2012，11（2）：219-226.

[17] 康立新，周玉玲，馬立新.殼聚糖酶的克隆表達與殼寡糖的制備分析[J].生物技術，2012，22（2）：20-23.

[18] 馮志彬，薛鈺，陳國忠，等.1株產(chǎn)殼聚糖酶細菌的分離、鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科學，2016，37（19）：171-176.

[19] ANDO A，SAITO A，ARAIS，et al. Molecular characterization of a novel family-46 chitosanase from Pseudomonas sp.A-01[J].Biosci Biotechnol Biochem，2008，72（8）：2074-2081.

[20] 戴秋萍.產(chǎn)殼聚糖酶海洋微生物菌株的篩選鑒定、發(fā)酵產(chǎn)酶條件和酶解產(chǎn)物性能研究[D].杭州：浙江大學，2012.

[21] ZHU X F，ZHOU Y，F(xiàn)ENG J L. Analysis of both chitinase and chitosanase produced by Sphingomonas sp. CJ-5[J].Journal of Zhejiang University，2007，8（11）：831-838.

[22] 石會會，高艷艷，王秀英，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2014（2）：54-57.

[23] 黃惠莉，蘇順發(fā)，許送彬，等.海洋青霉菌殼聚糖酶的分離純化與性能[J].化學工程，2011，39（10）：1-5.

[24] 蔡婀娜，黃惠莉，黃雙燕.海洋煙曲霉菌產(chǎn)殼聚糖酶的酶學性質(zhì)初探[J].暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版），2011，32（5）：509-512.

[25] 閻賀靜，周念波，涂邵勇，等.殼聚糖酶生產(chǎn)菌篩選、鑒定及其酶學性質(zhì)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2012（24）：161-164.