披堿草焦磷酸化酶基因EdHP1的功能分析

董建輝++徐晴++周容++盛敏++溫亮++龍小玲++樊軍++陳明

摘要：氫離子焦磷酸化酶（H+-PPase）是一類H+轉運蛋白，它以焦磷酸（PPi）水解底物，水解PPi產生的自由能與H+跨膜轉運相藕聯，將細胞質中的H+泵入液泡中，建立跨液泡膜電化學梯度，形成質子驅動力，為無機離子及其他溶質進出液泡提供動力，有利于植物維持細胞離子平衡和滲透平衡，增強植物的抗逆性。基于前期對披堿草（Elymus dahuricus）H+-PPase基因EdHP1克隆的基礎，對其表達譜及基因功能進行了進一步研究。結果表明，通過Northern blot分析發現，該基因在披堿草中受干旱、低溫非生物脅迫誘導表達。通過對轉EdHP1基因煙草在干旱、低溫環境下的功能分析發現，過表達EdHP1基因可以提高轉基因煙草對干旱、冷脅迫的抗性。

關鍵詞：披堿草（Elymus dahuricus）；焦磷酸化酶基因；表達分析；干旱；低溫

中圖分類號：Q74 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1963-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.041

Functional Analysis of H+-Pyrophosphatase Gene，EdHP1 of Elymus dahuricus

DONG Jian-hui1，XU Qing1，ZHOU Rong1，SHENG Min1，WEN Liang1，LONG Xiao-ling1，FAN Jun1，CHEN Ming2

（1.Hubei Academy of Agriculture Sciences，Wuhan 430064，China；2.Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Beijing 100081，China）

Abstract： H（+）-pyrophosphatase （H+-PPase） is an H+ transporter and taking the pyrophosphate （PPi） as substrate for hydrolysis. The free energy that produced by hydrolysis of pyrophosphate coupled with the trans-membrane transport of the H+ is able to pump the H+ from the cytoplasm into the vacuole，and form the electro-chemical gradient across the tonoplast and the proton motive force to promote the import and export of the inorganic ions and to maintain the ion balance and osmotic potential，finally to enhance the plant tolerance to stress. Based on the H+-PPase gene（EdHP1） had been cloned from E. dahuricus in previous studies，a further analysis of this gene，which including the expression and functional analysis of this gene under various stress conditions were performed in this study. Northern-blot analysis results showed that the expression of EdHP1 was induced by different abiotic stresses such as drought and cold of E. dahuricus. The functional analyses indicated that over-expression of EdHP1 enhanced the tolerance of transgenic tobacco plants to drought and cold in comparison with wild type plants.

Key words： Elymus dahuricus； H+-PPase； expression analysis； drought； cold

焦磷酸化酶（H+-PPase）既是H+轉運酶[1]，也是以焦磷酸（pyrophosphate，PPi）為底物的水解酶。該酶普遍存在于植物和少數光合細菌中，是植物液泡膜上的組分，約占膜蛋白的1%～10%[2]，參與合成糖類、核酸和蛋白質等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸的水解[3]。H+-PPase水解PPi產生自由能與H+跨膜轉運相耦聯，形成質子驅動力，與H+-ATPase將H+從細胞質泵入液泡中，為離子和其他溶質的次級轉運提供動能[4]；還可以建立跨液泡膜電化學梯度，為無機離子及其他溶質出入液泡提供驅動力[5，6]，既可以維持細胞離子平衡和滲透平衡，又能減輕一些無機離子（如Na+和Cl-）對細胞質的毒害；還能使液泡酸化和細胞質堿化，有助于細胞質中生理生化反應的順利進行。Davies等[7]和Obermeyer等[8]發現H+-PPase還參與K+向液泡內的運輸，用膜片鉗手段分別檢測甜菜（Beta vulgaris）和東亞市藜（Chenopodium rubrum） H+-PPase，結果表明，H+-PPase可能作為H+/K+共向轉運蛋白，介導K+向液泡內的運輸，其耦聯比為1.3H+/1.7K+/1PPi。但這種運輸是否是主動運輸目前還尚有爭議，有些學者在H+-PPase蛋白重組和42K+示蹤試驗中沒有發現K+的運輸過程[9]，Ros等[10]用熒光探針法也沒有檢測到H+-PPase對K+的主動運輸。Li等[11]發現擬南芥（Arabidopsis thaliana）H+-PPase（AVP1）除了酸化液泡外，還控制植物生長素的運輸，進而影響依賴生長素的各種發育過程。AVP1的過量表達導致植物器官形成時的細胞分裂、增生以及生長素運輸加快；相反，avp1-1突變體的根和地上部分發育都受到削弱，生長素運輸也變慢，其原因是AVP1基因的表達會影響與生長素分布有關的兩種蛋白（三磷酸腺苷酶和生長素外流介體PIN1）的分布和數量。AVP1作用的結果使生長素外流變得更加容易，從而促進根系發育和植株地上部分的生長。目前，從綠藻、擬南芥、大麥[12]等植物中克隆到了H+-PPase基因，功能分析表明，H+-PPase基因的過量表達可以增加轉基因植物的耐鹽及抗旱性[12]。

披堿草（Elymus dahuricus）是禾本科披堿草屬多年生優質牧草，須根發達，具有較強的抗旱、耐鹽堿能力。前期從披堿草中克隆了H+-PPase基因EdHP1[13]，并且構建了植物表達載體轉化煙草。對該基因的表達模式及其在抗逆性方面進行了分析，結果表明，EdHP1基因的表達受干旱、低溫的誘導，過表達EdHP1基因能提高轉基因煙草對干旱、低溫脅迫等逆境的抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 披堿草種子由內蒙古農業大學提供。將披堿草種子4 ℃春化3 d，然后播種在花盆中，取生長3周后的苗子分別進行干旱、ABA（200 μmo1/L）和4 ℃冷處理，處理時間分別為1、2、5、12、24 h，將處理后的苗子在液氮中冷凍后-70 ℃保存備用。

1.1.2 菌種、載體及試劑 表達載體pBI121、E. coli菌株DH5α和亞細胞定位載體163hGFP均為實驗室保存。pMD18-T Vector和小量膠回收試劑盒（Gel Extraction Mini Kit）為寶生物工程（大連）有限公司產品，限制性內切酶和T4連接酶購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 EdHPI基因克隆及生物信息學分析 依據EdHPI基因cDNA序列的5′端和3′端設計引物：EdHPI-R：5′GCTAGGTCTTGACCCTTTCCGATGGC 3′；EdHPI-L：5′GTTACTATGCAAGGTGAAGGAGGTAG3′。提取披堿草RNA，并進行純化后備用。利用DNAMAN序列分析軟件和TMHMM網站（http：//www.cbs.dtu.dk）對EdHPI甚因進行生物信息學分析。

1.2.2 EdHP1基因的Northern blot分析

1）電泳。電泳及轉膜用具0.1 mmol/L NaOH浸置過夜，然后用滅菌的0.1%DEPC水沖洗備用。在DEPC水處理過的配膠瓶中加入適量瓊脂糖（1.2%的瓊脂糖），加熱溶解瓊脂糖，冷卻到55 ℃，加入10×MOPS和甲醛，倒膠備用。將50 μL濃度為20 μg/μL的RNA 55 ℃水浴15 min后，置于在冰上，加入10 μL 5×RNA Loading Buffer，點樣。4～5 V/cm電泳，直到溴酚藍指示劑移出約8 cm，用滅過菌的10×SSC輕輕晃搖15 min去甲醛。

2）轉膜。轉膜過夜后，卸下轉膜裝置，用鉛筆標記膜號及點樣順序，紫外交聯3 min。

3）探針的制備及標記。根據RT-PCR引物（Primer-F：5′GCTATTGCAAGTAGTCTCCGATTAGG 3′；Primer-R：5′CATCATGATTCTGTCTGCTCCATGCTC3′）。反應程序：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環； 72 ℃延伸10 min，PCR擴增基因片段做探針。探針的標記使用Random Primer DNA Labeling Kit。

4）雜交。將雜交膜先放在水中預濕，將膜卷成筒狀，RNA面朝里，避免膜重疊用紗布隔開，放入雜交管中；在雜交管中倒入少量的預雜交液，沿一定方向轉動雜交管；倒掉預雜交液再加管預雜交液，65 ℃預雜交30 min；加入標記好的變性探針65 ℃雜交過夜。然后將雜交膜用洗液Ⅰ（2×SSC/0.1%SDS）和洗液Ⅱ洗后放入磷屏中壓4～5 d，把雜交膜放在沸騰的0.1%SDS溶液里面10 min，再放到2×SSC溶液中，探測同位素信號直到探測不到信號為止。

1.2.3 表達載體的構建 將pBI121載體用BamHⅠ、SacⅠ進行雙酶切，切除GUS基因，插入兩端引入BamHⅠ、SacⅠ酶切位點的EdHP1基因，獲得植物表達載體，并將該載體轉入農桿菌（C58C1）。

1.2.4 EdHP1基因的煙草轉化 葉盤法轉化煙草[14]。

1.2.5 轉EdHP1基因煙草的抗旱、耐低溫能力分析

選擇生長狀態一致的未轉基因煙草植株（Wt）和T0代陽性轉基因株系（EdHP1）進行無性繁殖，剪成多段帶有葉芽沒有根的莖稈插MS+2%PEG（干旱處理）的培養基上進行脅迫培養，培養條件是25 ℃，光照培養16 h/暗培養8 h，培養4周后觀察植株根及地上部分生長情況。冷處理為生長兩周左右的未轉基因煙草（Wt）和轉基因株系（EdHP1）在-4 ℃處理12 h后，轉入正常生長條件下恢復培養1周，觀察生長情況，并進行基因的表達分析。

2 結果與分析

2.1 EdHP1基因生物信息學分析

EdHP1基因的開放性閱讀框共有2 310 bp，編碼氨基酸770個（圖1A），蛋白分子質量是80.05 ku，等電點為4.89。在TMHMM網站（http：//www.cbs.dtu.dk）分析蛋白質結構發現EdHP1含有14個跨膜區（圖1B），并包含3個保守區：CS1（226-353 aa）、CS2（452-503 aa）和CS3（659-765 aa），其中CS1中的DVGADLVGKVE 氨基酸序列（圖1A）可能對EdHP1的催化起關鍵作用，表明其是一個典型的跨膜蛋白。

將EdHP1基因與其他高等植物的H+-PPase基因對比分析發現，核苷酸和氨基酸序列具有很高的同源性，跨膜區的保守性更高。利用DNAMAN軟件對EdHP1全長氨基酸序列開展進化樹分析結果顯示，EdHP1與大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、擬南芥（A. thaliana）、甜菜（B. vulgaris）、綠豆（Vigna radiata）、小麥（Triticum aestivum）、西洋梨（Pyrus communis）、苜蓿（Medicago truncatula）、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）的H+-PPase同源性都是86%以上，特別與大麥的H+-PPase同源性更是高達98%。與原生動物（Protozoa）、海藻類（Marine alga）的同源性只有40%（未列出），這說明H+-PPase在高等植物中具有很高的同源性（圖2）。

2.2 EdHP1基因的Northern blot分析

取不同脅迫條件下處理的披堿草材料，提取總RNA，進行Northern blot分析，用EdHP1基因為探針進行雜交。結果（圖3）表明，EdHP1在高鹽和干旱條件下有明顯誘導，從1 h開始逐漸增強，在24 h達到最大。在低溫脅迫條件下，EdHP1表達先增強后減弱，5 h表達量最高，12 h表達量下降。在ABA處理條件下沒有響應。

2.3 EdHP1轉基因煙草的抗逆性功能分析

2.3.1 EdHP1轉基因煙草的抗旱性分析 在MS+2%PEG的培養基上培養4周后，未轉基因煙草（Wt）地上和地下部分生長都受到了嚴重的抑制，而轉基因株系（EdHP1）形成了一定數目的根，且莖和葉的發育也明顯優于Wt（圖4B）。處理之前Wt和轉基因株系地上部分的平均長度分別為1.2 cm和1.1 cm（圖4C），處理之后轉基因株系地上部分的平均長度（4.5 cm）明顯比Wt（1.5 cm）長（P<0.01）（圖4D），處理之后轉基因株系地下部分的平均長度（5.5 cm）也明顯比Wt（0.1 cm）長（P<0.01）（圖4E）。為了進一步確定EdHP1基因的表達與轉基因煙草抗旱性的關系，對轉基因植株中該基因的表達進行了RT-PCR分析，結果表明，轉基因植株中EdHP1基因表達而在未轉基因煙草中沒有EdHP1基因的表達（圖4G）；對煙草中的H+-PPase活性進行測定發現轉基因煙草（EdHP1）是未轉基因煙草（Wt）的2倍以上（圖4F），這說明由于EdHP1基因的表達提高了轉基因煙草的抗旱性。

2.3.2 EdHP1轉基因煙草的耐低溫能力分析 生長兩周左右的未轉基因煙草（Wt）和轉基因株系（EdHP1）在-4 ℃處理12 h后，轉入正常生長條件下恢復培養過程中，Wt的莖葉逐漸失綠，最終枯死（圖5B），而轉基因株系植株沒有受到明顯的影響，生長恢復（圖5B）。RT-PCR結果表明，在轉基因植株中EdHP1基因表達，而在Wt中則沒有EdHP1基因的表達（圖5C）。這說明由于EdHP1基因的表達提高了轉基因煙草的耐低溫能力。

3 討論

H+-PPase具有質子泵的功能，可以分解PPi為離子的運輸和一些次級代謝提供能量，在這方面和ATP具有類似的功能，在逆境下H+-PPase還可以提高ATP的活性。目前，H+-PPase基因對低溫脅迫的響應方式也有不同看法，Yoshida等[15]報道綠豆苗H+-PPase在低于10 ℃的溫度下，H+-PPase質子轉運速率降低。但在檢測2 ℃處理的綠豆懸浮細胞H+-PPase活性后認為，冷處理期間H+-PPase較為穩定，48 h以內沒有表現出明顯受抑制現象，甚至在處理的最初12 h內還稍有促進。Carystinos等[16]則發現冷誘導H+-PPase活性大幅度上升，10 ℃冷處理6 d的水稻苗H+-PPase比活是常溫（25 ℃）下的20倍，同時免疫反應蛋白也顯著增加，說明H+-PPase是冷誘導。在本試驗中EdHP1對4 ℃處理的響應是先升高后降低，表明EdHP1基因參與了植物對低溫的響應。Brini等[17]將H+-PPase轉入擬南芥發現轉基因植物的耐旱性得到明顯的提高，Park等[18]將AVP1基因轉入番茄（Lycopersicon esculentum）的一個商業栽培品種中，轉基因植株抗旱性明顯增強。Gao等[19]將鹽芥中的H+-PPase轉入擬南芥發現轉基因植物的耐鹽性得到明顯的提高。可見，H+-PPase作為一種有效的質子泵，在植物對水分和鹽分脅迫的響應中可能扮演著重要的角色。EdHP1能夠顯著提高轉基因煙草抗旱性和耐低溫能力，推測可能的作用機制是EdHP1影響了生長素的運輸，促進了根系和地上部分的生長，從而提高了植物的抗逆性，由此可見EdHP1可以作為優良的基因資源用于改良作物的抗逆性。

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