元素分析儀與質譜儀聯用鑒定蜂蜜摻假的研究

陳亞威， 張業鵬

(湖北工業大學機械工程學院， 湖北 武漢 430068)

元素分析儀與質譜儀聯用鑒定蜂蜜摻假的研究

陳亞威， 張業鵬

(湖北工業大學機械工程學院， 湖北 武漢 430068)

絕大多數的天然蜂蜜均來自C3植物，其總體蜂蜜和蜂蜜蛋白均來自相同的植物碳源，二者的碳同位素組成應該相等，即δ13CH=δ13CP。由于商業利益驅使的一些摻假行為，例如摻入C4植物糖漿，總體蜂蜜δ13CH發生改變，變化大小取決于摻假量和摻假糖漿的δ13C，但是蜂蜜蛋白δ13CP很穩定幾乎不變。本實驗利用穩定同位素技術鑒定62個蜂蜜樣品，結果顯示有19.35%的蜂蜜不合格，摻假摻雜主要以添加碳-4植物源轉化產物和淀粉糖漿為主。

元素分析-同位素質譜； 蜂蜜； 摻假；δ13C值

蜂蜜中主要含葡萄糖、果糖和蔗糖，以及豐富的蛋白質、氨基酸、有機酸、多種維生素和礦物質等，特別是其含有淀粉酶、蔗糖轉化酶、過氧化氫酶和脂酶等多種活性酶類。由于近些年蜂蜜在國內外需求量的增大，我國蜂蜜年銷量遠大于產量，導致蜂蜜摻假摻雜行為出現。目前，測定蜂蜜摻假的主要方法有液相色譜示差折光檢測法、薄層色譜法(TLC法)、糖類指紋圖譜法、元素分析同位素比值質譜法和離子色譜法等。對于現在市面上的摻假手段，如在蜂蜜中加入C3或C4植物糖漿，以上方法耗時長，受干擾多，靈敏度不高。隨著穩定同位素比質譜技術的發展，以及連續流在線裝置的集成化、多功能化和多樣化，穩定同位素分析結果成為快速評鑒蜂蜜是否摻假的強有力證據。穩定同位素比質譜儀與Flash 2000元素分析儀聯用，實現了快速高效、高精度和準確度測定總體蜂蜜δ13CH和蜂蜜蛋白δ13CP，成為國內外商品蜜檢測工具。

1 實驗準備

1.1 實驗樣品

本實驗所有蜂蜜來源于湖北省食品質量安全監督檢驗研究所日常抽檢的62個蜂蜜樣品。

1.2 材料與試劑

鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)、超純水(Millipore公司)、硫酸(H2SO4)、錫杯(8 mm×5 mm)、標準物質(IAEA)、0.45 μm水相濾膜。

分別制備10%的鎢酸鈉溶液和0.335 mol/L硫酸溶液。

1.3 主要儀器設備

Flash 2000 HT元素分析儀，與元素分析儀聯用的Delta V Advantage穩定同位素比質譜儀(EA-IRMS)，恒溫水浴鍋，低速離心機。

1.4 樣品制備

制備總體蜂蜜和蜂蜜蛋白，使用錫囊包裹。制備已知δ13C標準物質(如Caffeine)，使用錫囊包裹。

總體蜂蜜的制備：將蜂蜜樣品充分攪拌，分出試樣，裝入樣品瓶，密封，常溫下保存。蜂蜜試樣經0.10～0.14 mm孔徑尼龍濾布過濾，除去試樣中固體雜質后，使用百(十)萬分之一天平稱取0.05 g，再用錫杯包裹。按上述方法重復制備3份式樣。

蜂蜜蛋白的制備：稱取10 g左右干凈的蜂蜜樣品于50 mL離心管中，然后在離心管中加入5 mL的超純水后充分混勻。在一個50 mL的燒杯里分別加入2.0 mL 10 % 的鎢酸鈉溶液和2.0 mL 0.335 mol/L的硫酸溶液，迅速混勻后，再加到上述盛蜂蜜試樣的離心管中，然后再混勻。把混勻后的蜂蜜樣品離心管放置于80℃水浴鍋中震蕩加熱不少于60 min，注意在加熱的過程中每間隔5～10 min把蜂蜜樣品離心管拿出來再振蕩20 s，直到有絮狀物析出。用超純水注滿離心管并充分混勻后放入離心機，在3500 r/min的轉速下離心5 min，后棄去上層清液，用超純水充分洗滌沉淀物，如此反復離心和洗滌沉淀物5次，最后把上清液倒完，將含有全部沉淀蛋白質的離心管置于80℃烘箱中烘干3 h 以上。使用百(十)萬分之一天平稱取烘干的蛋白試樣80～120 μg，再用錫杯包裹。每個蜂蜜蛋白樣品可重復制備3個。未有絮狀物析出的試樣，繼續補加10 % 鎢酸鈉溶液和0.335 mol /L硫酸溶液各2.0 mL，離心5 min后仍未見沉淀，認為是無蛋白蜂蜜樣品。把含有蛋白的蜂蜜樣品包好入錫杯中備用。

1.5 實驗條件

EA-IRMS質譜條件：氧化管溫度，1 000℃；還原管溫度，825 ℃；爐溫，50℃；真空度，1.0×10-6Pa；氦氣流速，120 mL/min；GC管溫，90℃。每個樣品平行測定2次。

2 實驗原理

采用Flash 2000 HT元素分析儀與Delta V Advantage穩定同位素比質譜儀聯用設備，在線測定總體蜂蜜和蜂蜜蛋白的δ13C。將處理好的試樣裝入錫囊中，通過固體自動進樣器，載入具有純氧脈沖、氧化還原劑、脫鹵去硫劑存在的在線式全自動Flash燃燒管中，試樣中的有機碳全部轉化為CO2，經化學純化及GC分離，由ConFlo IV裝置的Open Split接口，導入IRMS中，測定CO2的δ13C，就相當于原試樣中有機碳的δ13C。

Flash 2000 HT元素分析儀的氧化爐和還原爐采用一體化設計，即動態快速燃燒爐，與氧化爐和還原爐分開設計相比，具有更低的樣品消耗量和更高的靈敏度。在動態快速燃燒模塊中，Flash燃燒管從下到上依次填充Ag2Co3O4、Cu和Cr2O3這三種化學填料，分別用作脫鹵去硫劑、還原劑和氧化劑，不同的化學填料之間通過薄層石英棉隔開。

另外，Flash 2000 HT元素分析儀的另一端還配置了高溫裂解 (TC/EA)模塊。這樣，一臺元素分析儀就實現了多元素 (C/N/H/O)的同位素比測定，更有利于后續開展蜂蜜試樣的多元素同位素比值分析和真實性鑒別工作。

3 實驗過程

包裹好的蜂蜜樣品，按照已創建的測試序列，依次擺放在固體進樣器的樣品盤上(第1個樣品放在進樣口，后面的樣品依次擺放)，然后蓋上盤蓋，待上機測定。

在計算機上打開Acquisition軟件窗口，在Flash HT / CO2模式下，打開待測序列，選擇待測目標，點擊Start，在彈出的Start Sequence窗口，為Results文件夾和Results文件命名，然后開始測試。計算機會自動給出蜂蜜樣品的δ13C值。

4 實驗結果與分析

62個蜂蜜樣品的測試結果見表1。

表1 EA-IRMS測定不同蜂蜜樣品的穩定碳同位素比值 ‰

從表1的統計數據來看，本實驗中蜂蜜樣品中總的δ13CH值和蜂蜜蛋白δ13CP的值的范圍在-24.3‰～-26.9‰之間變化，大部分蜂蜜的δ13CH值和蜂蜜蛋白δ13CP都十分接近，根據美國分析化學家協會正式分析方法(AOAC 998.12)和中華人民共和國國家標準方法(GB/T 18932.1-2002)，采用動態燃燒裝置與穩定同位素比質譜儀聯用技術測定總體蜂蜜δ13CH和蜂蜜蛋白δ13CP，根據同位素質量平衡方程可計算商品蜂蜜中的C4植物糖漿的碳含量

這里， -9.7代表一般地C4植物糖漿的δ13C平均值 (‰)。當計算結果為負值時，其C4植物糖含量按0計；當計算結果大于或等于7 % 時，應認為含有C4植物糖(主要指玉米糖或甘蔗糖)，即認為摻假。

表1中9、10、11、47號等11個蜂蜜樣品中是沒有提取出來蜂蜜蛋白的，由于真實蜂蜜中含有蛋白，所以這11個蜂蜜樣品為假蜂蜜樣品。而36號蜂蜜樣品計算結果C4大于7%，所以36號蜂蜜樣品也為摻假蜂蜜樣品。其他蜂蜜樣品C4均小于7%，所以在使用本實驗方法時，有12個蜂蜜樣品判定為摻假蜂蜜樣品，占蜂蜜樣品總數的19.35%。

圖1為測定純蜂蜜的δ13C的離子流強度-時間(Intensity-Time)譜圖，前面連續2個參考氣CO2的平峰脈沖，蜂蜜試樣中的碳，經過在線快速燃燒和恒溫GC分離，全部轉化為CO2，進行同位素比質譜分析，樣品氣CO2在譜圖上顯示為尖峰。

圖 1 EA-IRMS方法測定蜂蜜碳δ13C的離子流強度-時間的譜圖分析

使用電阻各不相同的萬用三杯接收器分別接收m/z 44、m/z 45和m/z 46的離子流，在譜圖上以電

壓信號表示，所有CO2脈沖的離子流強度由低到高依次為m/z 44、m/z 45和m/z 46。根據參比峰和樣品峰的m/z 45與m/z 44離子流強度之比，得出樣品氣CO2的13C/12C。每個蜂蜜試樣重復測定3次，δ13C測定精度均好于0.15‰。說明本實驗精度較高，結果準確。

[1] GB/T 18932.1-2002. 蜂蜜中碳-4 植物糖含量測定方法-穩定碳同位素比率法[S].

[2] GB/T 18932.22-2003.蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測定方法-液相色譜示差折光檢測法[S].

[3] 費曉慶,吳斌,沈崇鈺,等.液相色譜/元素分析-同位素比值質譜聯用法鑒定蜂蜜摻假[J].色譜,2011,29(1):15-19.

[4] 丁濤. 液相色譜-同位素質譜聯用法在蜂蜜摻假鑒定方面的應用[C].第四屆華東地區色譜、質譜學術報告會, 2010.

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[8] 黃文誠. 用不同的方法檢測高果糖玉米糖漿摻假的蜂蜜[J]. 中國蜂業, 2009, 60(9):51-52.

[9] 羅東輝,羅海英,冼燕萍,等.同位素質譜聯用技術鑒別無蛋白蜂蜜的真實性[J]．現代食品科技，2012，28(7)：862-866．

[責任編校： 張 眾]

Element Analyzer with a Stable Isotope Ratio Massspectrometry Combined with Identification of Adulteration in Honey

CHEN Yawei, ZHANG Yepeng

(SchoolofMechanicalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Honey is a kind of high-quality natural sweetening agent. The vast majority of natural honey comes from C3 plants. The overall honey and honey protein are from the same plant carbon source, whose carbon isotope composition should be equal; that is, Delta13CH= Delta13CP. Due to some adulteration of commercial interest, for example, the incorporation of plant C4 syrup, honey, overall13CHis changed depending on the size and amount of syrup adulteration adulteration of delta13C; however, Delta13CPprotein is stable but honey is almost the same. In this study, 62 honey were identified by stable isotope technique.The results showed that 19.35% samples of honey adulteration is not qualified, mainly because carbon doped -4 plant transformation products and starch syrupwere were added. Therefore,the monitoring and management of this kind of adulteration should be strengthened.

elemental analysis isotope mass spectrometry；honey；adulteration；δ13C

2017-03-08

陳亞威(1991-)， 男，湖北武漢人，湖北工業大學碩士研究生，研究方向為食品質量控制與檢測

1003-4684(2017)02-0021-03

S896.1, TS207.3

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