納米凝膠對阿霉素的高效包載及釋藥評價

尚星星， 郭夢芹， 陳 婷， 祝紅達

(湖北工業大學生物工程與食品學院， 湖北 武漢 430068)

納米凝膠對阿霉素的高效包載及釋藥評價

尚星星， 郭夢芹， 陳 婷， 祝紅達

(湖北工業大學生物工程與食品學院， 湖北 武漢 430068)

以阿霉素為抗腫瘤模型藥物，評價PNIPAM-co-AA納米凝膠顆粒作為藥物載體對藥物的包載及體內體外釋藥行為?？疾觳煌h境下PNIPAM-co-AA納米凝膠親疏水特性的變化對阿霉素載藥性能的影響，同時評價載阿霉素納米凝膠的體內體外釋藥行為。采用納米凝膠凍干粉在鹽酸阿霉素溶液中緩慢溶脹的載藥方式具有更高的包載效率，其包封率為88.28%±0.52%,載藥量為7.48%±0.14%；載阿霉素納米凝膠的體外釋藥行為具有顯著緩釋作用和pH控制釋放效應；載阿霉素納米凝膠大鼠靜脈給藥后曲線下面積AUC(0→∞)是游離阿霉素靜脈給藥的4.9倍，而消除半衰期t1/2β由游離阿霉素的0.83 h延長至10.83 h。PNIPAM-co-AA納米凝膠作為藥物載體能高效包載阿霉素，體內釋藥行為體現出一定的長循環特征。

阿霉素； 納米凝膠； pH敏感； 長循環

納米凝膠作為一種納米尺度的聚合物材料，不僅具有水凝膠親水性、可溶脹性等優點，還具有生物相容性、高載藥量能力、強穩定性、環境刺激響應等特性，因而其在藥物傳遞、生物組織工程等納米醫藥領域引起廣泛關注[1-4]。 pH和溫度變化是人體體液復雜環境中的兩個重要因素，利用這兩種刺激信號的變化進行藥物釋放行為的控制是藥物載藥系統研究熱點之一[4]。本文考察了不同環境下聚N-異丙基丙烯酰胺-co-烯丙基胺(PNIPAM-co-AA)納米凝膠親疏水特性的變化對模型藥物阿霉素載藥性能的影響，同時評價載阿霉素納米凝膠的體內體外釋藥行為。

1 試劑和儀器

p(NIPAM-co-AA)納米凝膠(自制)，鹽酸阿霉素(北京華豐聯合科技公司)，柔紅霉素(化學對照品，中國藥品生物制品檢定所)，NH4H2PO4等常規化學試劑(天津市科密歐化學試劑開發中心，均為分析純)，乙腈、甲醇(HPLC級，Tedia，美國)；超濾管(Milipore 截留分子量10 K)；熒光分光光度計((F-4500，Hitachi)，Agilent 1100 高效液相色譜系統(熒光檢測器，美國)。

2 實驗方法

2.1 p(NIPAM-co- AA)納米凝膠對阿霉素的包載及包封率、載藥量的測定

為了研究載藥方式對納米凝膠包封率的影響，采用A, B兩種載藥方式。A方式：2.5 mg鹽酸阿霉素用少量超純水溶解后用pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液(0.01mol/L) 定容到50 mL，取500 mg凝膠凍干粉加入到DOX溶液中，避光磁力攪拌，待凝膠完全溶脹后用NaOH (0.02 M) 溶液調pH到7.4，繼續避光攪拌6 h，4℃下避光保存。B方式: 取500 mg凝膠凍干粉投入到25 mL超純水中磁力攪拌48 h，使其充分溶脹；2.5 mg阿霉素 (DOX ) 溶解于25 mL超純水中，將兩種溶液混溶，用NaOH (0.02 M) 溶液調pH到7.4，避光磁力攪拌24 h，4℃下避光保存。

采用超濾管(Milipore 截留分子量10K)分離去除游離藥物，采用熒光分光光度法分布測定游離藥物濃度，按下列公式計算納米凝膠的包封率和載藥量：

2.2 載阿霉素p(NIPAM-co- AA)納米凝膠的體外釋藥行為

采用透析法評價載阿霉素p(NIPAM-co-AA)納米凝膠體外釋放行為[5]。取3份3 mL的載藥納米凝膠到透析袋(截留分子量為8000～14 000)中密封，分別投入裝有100 mL磷酸鹽緩沖液( 0.01 mol/L， pH 分別為7.4、6.5、6.0)的錐形瓶中，將錐形瓶置于37℃恒溫振蕩搖床中，于不同時間點(0.167，0.333，0.5，1，2，4，8，12，24 h)從錐形瓶中取2 mL接受介質，同時補加同等體積的釋放介質到瓶中保持溶液體積的恒定。用熒光分光光度計在λex=500 nm和 λem=556 nm，EX分別為5.0 nm；PMT Voltage：700 V條件下，測定DOX.HCL系列濃度標準溶液的熒光值，根據熒光值和對應的DOX濃度，分別繪出DOX在pH 6.0、6.5、7.4條件下熒光標準曲線。通過外標法測定計算接收介質中藥物濃度，繪制累積濃度-時間的函數曲線，得到對應的載藥凝膠在不同pH條件下的釋放曲線。

2.3 載阿霉素p(NIPAM-co- AA)納米凝膠大鼠體內藥代動力學評價 2.3.1 分組與給藥 10只大鼠(Wister大鼠，湖北省疾病預防控制中心提供，雌雄各半，體重200～240 g)，隨機分為2組，每組5只。分別為阿霉素注射液給藥組(2 mg/mL)，載阿霉素納米凝膠(DOX-Nanogel)給藥組(2mg/mL)，兩組給藥劑量均為8 mg/kg。大鼠尾靜脈注射給藥后，分別于給藥后0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 h從大鼠眼眶后靜脈叢取血約0.4 mL于肝素化EP管中，離心取血漿，置于-20℃冰箱保存備用[6]。

2.3.2 大鼠血漿中阿霉素含量測定方法的建立 阿霉素含量測定采用HPLC法，色譜條件為：色譜柱Hypersil C18column，5 μm, 250 mm×4.6 mm；柱溫，30 ℃；流速，1 mL/min；流動相，0.02 mol/L(V(NH4H2PO4)∶V(CH3CN)∶V(冰乙酸)=60∶40∶0.1；進樣體積，20 μL；熒光條件，λEX/λEM=496 nm/550 nm[5]?？疾煸谏鲜錾V條件下阿霉素與內標柔紅霉素的色譜圖，以阿霉素和柔紅霉素的保留時間、分離度和理論塔板數為指標，確定最適宜的色譜條件。分別考察大鼠空白血漿樣品、空白血漿樣品加入阿霉素和內標柔紅霉素以及給藥后的血漿樣品，按照2.3.1建立的方法處理樣品，考察色譜系統的適用性[6]。

依次配制濃度為20、10、5、2、1 μg/mL的DOX標準溶液和20 μg/mL的柔紅霉素內標工作液，用于血漿標準曲線的制備。取7份200 μL的大鼠空白血漿分別加入柔紅霉素內標工作液(20 μg/mL)和阿霉素標準溶液，使阿霉素的血漿藥物濃度依次為 6.25, 3.125, 1.54, 0.833, 0.313, 0.154, 0.083 μg/mL的血漿樣品。上述標準血漿樣品中分別加入1 mL提取液(0.3 mol/L(V(鹽酸) :V(無水乙醇)=37)渦旋振蕩提取5 min，然后以12 000 r/min離心15 min，吸取上清液400 μL進樣。以血漿中阿霉素的濃度為橫坐標(X)，阿霉素和柔紅霉素峰面積比值的平均值為縱坐標(Y)建立標準曲線。

2.3.3 血藥濃度測定及數據處理 取不同時間點大鼠血漿樣品200 μL置于4 mL EP管中，按2.3.2方法加入內標溶液后提取進樣，測定不同時間點血漿樣品中阿霉素的濃度。采用藥動學軟件(DAS2.0)處理血藥濃度，獲得相關藥代動力學參數，包括血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)、消除半衰期(t1/2)、表觀分布容積(Vd)和清除率(CL)。

3 結果與討論

3.1 載藥方式對納米凝膠包封率的影響

研究證明納米凝膠的三維網絡對親水性活性分子具有較好的包載和控制釋放能力[7]。p(NIPAM-co-AA)納米凝膠結構中含有丙烯胺基團，在偏酸性環境(pH6.5)中帶正電，而DOX的pKa為8.2，在酸性環境中帶負電。物理包埋法載藥的設計原理是在偏酸性環境中，帶正電的大分子通過靜電作用力與帶負電的小分子靜電結合，納米凝膠顆粒內部的網絡結構為DOX提供了貯留空間[1]。因此將鹽酸阿霉素通過物理包埋法嵌合進納米凝膠的交聯網絡中，同時考察在物理包埋載藥過程中不同載藥方式對包封率和載藥量的影響。結果p(NIPAM-co-AA)納米凝膠載阿霉素采用A方式，即納米凝膠凍干粉在鹽酸阿霉素溶液中緩慢溶脹載藥的包封率為88.28%±～0.52%,載藥量為7.48%±0.14%，而采用B方式即納米凝膠水分散體系與鹽酸阿霉素溶液混合攪拌載藥的包封率只有18.35%±0.32%，載藥量為1.56%±0.03%。這個結果說明，采用不同混合方式對納米凝膠物理包埋載藥的包封率和載藥量有很大影響，納米凝膠凍干粉在鹽酸阿霉素溶液中緩慢溶脹，阿霉素分子隨著水分子更多進入納米凝膠網絡中，而在水中已經充分溶脹的納米凝膠因凝膠網絡中已存在大量水分子，使得網絡空間減少，對阿霉素的包載減小。

3.2 載阿霉素p(NIPAM-co- AA)納米凝膠的體外釋藥行為

人體的血液、實體腫瘤，以及細胞溶酶體環境中的pH分別為7.4, 6.8及5.0，通過對pH值響應型納米凝膠的結構設計可實現對人體特定部位的藥物釋放。大量文獻報道，將帶有酸或堿性基團的分子引入納米凝膠結構中實現納米凝膠對pH值的響應性溶脹，實現對藥物的控制釋放。

采用熒光分光光度計檢測不同pH條件下載阿霉素納米凝膠的體外釋藥，結果顯示釋藥行為表現出顯著的pH敏感性。由圖1可知，載阿霉素的p(NIPAM-co- AA)納米凝膠具有顯著緩釋作用，鹽酸阿霉素溶液2 h累積釋放率接近100%，而載阿霉素納米凝膠在pH6.0, pH6.5和pH7.4環境下2 h的累積釋放率分別為54.9%±2.25%,65.3±6.25%和63.9%±1.94%；由于阿霉素是以靜電吸附的方式包載于納米凝膠顆粒網絡中，一部分吸附于顆粒表面的阿霉素分子很容易從凝膠顆粒表面脫吸附釋放進入介質，所以載藥凝膠釋藥初期存在快速釋放的現象。載藥凝膠體外釋藥行為也表現出明顯的pH響應性，載藥納米凝膠在pH7.4, pH6.5和pH6.0環境下12 h的累積釋放率分別為68.53%±2.17%,89.9%±2.1%和95.1%±6.58%，酸性環境下載藥凝膠的釋藥量要顯著高于中性環境。酸性環境下p(NIPAM-co- AA)納米凝膠處于親水狀態，納米凝膠溶脹體積變大，貯存于凝膠網絡中的阿霉素在酸性環境也為親水狀態，因此更易擴散到釋放介質中；而在37 ℃時的中性環境中納米凝膠為疏水狀態，納米凝膠顆粒因疏水體積減小，同時阿霉素在中性條件下不能充分地質子化，也處于疏水狀態，導致阿霉素在凝膠內部的疏水微區不易釋放出來。

圖 1 載阿霉素p(NIPAM-co- AA)納米凝膠在不同pH條件下體外釋藥曲線

圖 2 阿霉素注射劑和載阿霉素納米凝膠在大鼠體內的血時曲線(n=5)

3.3 血漿中阿霉素含量測定方法的建立

在2.3.2項色譜條件下，DOX和內標柔紅霉素的保留時間分別為5.7 min和9.8 min，血漿中雜質對DOX和柔紅霉素的測定無干擾。本文選用柔紅霉素為內標基于所選的內標物與DOX具有相似的結構且有明顯差異的保留時間，穩定性好，萃取回收率穩定。DOX在0.083-6.25?倕g/mL濃度范圍內，DOX濃度(C)與DOX和柔紅霉素峰面積之比Y之間成具有良好的線性關系(R=0.9995)，回歸方程Y=3.0769C-0.0131。

3.4 體內藥代動力學行為

分別以8 mg/kg劑量給予大鼠尾靜脈注射載阿霉素p(NIPAM-co- AA)納米凝膠和市售阿霉素注射劑后，大鼠體內的血藥濃度-時間曲線見圖2。從圖2可知，市售阿霉素注射液大鼠尾靜脈注射后，藥物在8 h內消除90%以上；而包裹在納米凝膠的阿霉素靜脈注射后大鼠體內的釋藥行為類似口服給藥的體內釋藥曲線，給藥15 min,, 血藥濃度為2.71%±0.39 μg/ml，在2 h時達到Cmax(5.34±0.57 μg/ml)，2 h后藥物開始消除，但消除速度明顯低于市售阿霉素注射液靜脈給藥時的消除速度，在2 h到12 h內血藥濃度維持在一個相對穩定的值，24 h大鼠體內血藥濃度為0.42±0.08 μg/mL，顯著高于游離阿霉素給藥24 h后的血藥濃度0.12±0.05 μg/mL。當包載阿霉素的納米凝膠顆粒以靜脈注射的給藥方式進入血液循環后，存在復雜的體內過程，因此表現出不同平常的靜脈給藥釋放行為[1]。在靜脈注射包載阿霉素的納米凝膠顆粒到血液后的2 h內，DOX從納米凝膠中釋放與體循環中游離DOX的消除是占主導的兩個過程，這兩個過程相互競爭[8]。體外藥物釋放實驗結果發現：包載阿霉素的納米凝膠顆粒在前2 h的累計釋放率達到50%以上，而體內環境中由于各種降解酶的存在藥物釋放可能比體外更快[9]，所以前2 h血藥濃度有升高的過程；而2 h后藥物從納米凝膠網絡中釋放速度小于藥物在體內的消除速度，血藥濃度隨時間逐步減小。所以在體內，包載阿霉素的納米凝膠顆粒的藥物濃度在0～2 h，表現出非常規的消除趨勢。

不同時間點的血藥濃度經DAS2.0系統處理后進行曲線擬合，兩個給藥組均符合二室模型，其藥物動力學參數見表1。從表1中知，載阿霉素納米凝膠與游離阿霉素比較，前者的清除率小于后者的相應值，而半衰期和生物利用度均大于后者的相應值；載阿霉素納米凝膠靜脈給藥后曲線下面積AUC(0→∞)是游離阿霉素靜脈給藥的4.9倍，而消除半衰期t1/2β由游離阿霉素的0.83 h延長至10.83 h。由此可見，納米凝膠作為藥物載體包載阿霉素時靜脈注射給藥體現出了一定的長循環特征。這可能是由于納米凝膠作為載體能控制藥物緩慢釋放，同時丙烯胺與NIPAM聚合形成的納米凝膠具有兩親性，在一定程度上降低了納米凝膠顆粒被巨噬細胞吞噬的程度，使其具有一定的長循環特征。

表1 阿霉素注射劑和載阿霉素納米凝膠大鼠體內

4 結束語

將鹽酸阿霉素通過物理包埋法嵌合進納米凝膠的交聯網絡中，同時考察在物理包埋載藥過程中不同載藥方式對包封率和載藥量的影響。結果采用納米凝膠凍干粉在鹽酸阿霉素溶液中緩慢溶脹的載藥方式下具有更高效的包載效率：包封率為88.8%±0.52%,載藥量為7.48%±0.14%；載阿霉素的PNIPAM-co-AA納米凝膠的體外釋藥行為顯示，與鹽酸阿霉素溶液比較，載藥凝膠具有顯著緩釋作用和pH控制釋放效應；體內藥代動力學實驗結果表明，載阿霉素納米凝膠靜脈給藥后曲線下面積AUC(0→∞)是游離阿霉素靜脈給藥的4.9倍，而消除半衰期t1/2β由游離阿霉素的0.83 h延長至10.83 h，由此說明納米凝膠作為藥物載體包載阿霉素用于靜脈注射給藥體現出了一定的長循環特征。

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[責任編校： 張 眾]

PNIPAM-co-AA Nanogels for Active Loading of Doxorubicin and Evaluation of Controlled Release

SHANG Xingxing, GUO Mengqin, CHEN Ting, ZHU Hongda

SchoolofBiologyEngin.andFood,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China

Doxorubicin (DOX) was used as an anticancer drug model to evaluate the drug loading capability of PNIPAM-co-AA nanogels and controlled release in vitro and in vivo as a drug carrier. For high drug-loading capacity, the effects of the hydrophobicity and hydrophilicity of PNIPAM-co-AA nanogels in the defferent condition were investigated, and controlled releasing behavior of DOX-laoded nanogels in vitro and in vivo were evaluated. Results show that PNIPAM-co-AA nanogels have higher encapsulation efficiency (EE) of 88.8 ± 0.52 % and drug loading capacity of 7.48 ± 0.14% for DOX, when Lyophilized PNIPAM-co-AA nanogels were dispersed in the DOX solution. The release behavior of DOX-laoded nanogels has a significant sustained-release effect, pH-controlled release effect and prolonged blood circulation in vitro and in vivo. PNIPAM-co-AA nanogels have the potential to be developed as an effective drug delivery system for cancer chemotherapy.

DOX; Nanogels; pH-responsive; Prolonged blood circulation

2017-02-28

國家自然科學基金資助項目(81201197)；湖北省自然科學基金資助項目(2015CFB588)

尚星星(1991-)， 女，湖北襄陽人，湖北工業大學碩士研究生，研究方向為藥劑學

祝紅達(1974-)，女，湖北荊州人，工學博士，湖北工業大學副教授，研究方向為新型給藥系統

1003-4684(2017)02-0038-04

R943

A