甘油和生物素對釀酒酵母產胞內谷氨酸的影響

劉立聰，湯 超，王 志，代 俊，李 欣，姚 娟，鄭國斌，呂正波，陳 雄

(1 湖北工業大學生物工程與食品學院，發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068；2 湖北省酵母功能重點實驗室，安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；3 安琪酵母(德宏)有限公司，云南 德宏 678400)

甘油和生物素對釀酒酵母產胞內谷氨酸的影響

劉立聰1，湯 超1，王 志1，代 俊1，李 欣1，姚 娟2，鄭國斌2，呂正波3，陳 雄1

(1 湖北工業大學生物工程與食品學院，發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068；2 湖北省酵母功能重點實驗室，安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；3 安琪酵母(德宏)有限公司，云南 德宏 678400)

為降低Crabtree效應，提高釀酒酵母胞內谷氨酸的產量，研究補料物質分別為純糖蜜、甘油加糖蜜以及甘油加糖蜜加生物素等3種條件下釀酒酵母的生長代謝。結果表明：用甘油替代部分糖蜜進行流加，可以降低Crabtree效應，但碳源利用率顯著降低；在此基礎上添加生物素后，既降低了Crabtree效應，又解決了碳源利用率低的問題；其中流加800 mL糖蜜、300 g甘油和4 mg生物素時，胞內谷氨酸含量在12 h達到3.04%，比只流加糖蜜時的峰值2.28%(18 h)提高33.3%，而且發酵周期縮短了6 h。

Crabtree效應； 釀酒酵母； 甘油； 生物素； 胞內谷氨酸

酵母抽提物具有豐富的營養價值，作為新一代集營養、調味和保健為一體的天然高級調味料，越來越受到廣泛關注[1-2]。酵母抽提物含有18種以上氨基酸，但存在總體呈味上比味精強而鮮度不突出的缺點[3-4]，其谷氨酸的含量不足是其主要原因之一[5]。這與酵母抽提物的制備工藝和釀酒酵母突出丙酮酸脫羧進入乙醇合成途徑、弱化三羧酸循環途徑(TCA)碳流量的遺傳背景有關[6]，致使胞內谷氨酸含量偏低以及胞內蛋白水解后總谷氨酸含量不穩定。

釀酒酵母存在明顯的Crabtree效應，也使碳代謝溢流向乙醇合成途徑而對TCA以及谷氨酸合成不利[7-8]，而且基礎碳源(如葡萄糖)濃度越高，Crabtree效應強度也越強，溢流合成乙醇效應越大[9]。顯然，Crabtree效應是提高釀酒酵母胞內谷氨酸合成效率的一個瓶頸。

釀酒酵母工業發酵通常以糖蜜(含30%蔗糖)為主要碳源，通過遲效碳源替代部分糖蜜可能會減弱Crabtree效應。甘油作為一種較為經濟的遲效碳源，能被釀酒酵母利用并與乙醇代謝有著密切關系[10-11]。考慮到糖蜜中含有一定量的生物素[12]及其對糖代謝速率和CO2固定的影響[13-14]，以甘油部分替代糖蜜后，添加適宜濃度的生物素是必要的。但是，目前有關為降低釀酒酵母Crabtree效應、提高胞內谷氨酸含量的策略還未見報道，如何在碳代謝水平優化碳流進入谷氨酸合成途徑，是富谷氨酸酵母生產過程中至關重要的問題。

為了提高釀酒酵母的生物量和胞內谷氨酸的含量，本研究優化了補料成分及其組成，確定了合適的甘油和生物素流加方式，降低了乙醇的生成效率，顯著提高了胞內谷氨酸含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)J-5由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 培養基 斜面培養基：蔗糖，50 g/L；酵母浸粉，20 g/L；MgSO4·7H2O，1 g/L；KH2PO4，1 g/L；pH， 4.8～5.0。121 ℃滅菌20 min。

種子培養基(YS培養基)：蔗糖，100 g/L；酵母浸粉，20 g/L；MgSO4·7H2O，1 g/L；KH2PO4，1 g/L；pH，4.8～5.0。250 mL三角瓶裝液量50 mL，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：糖蜜(含30%蔗糖)，100 mL/L；酵母浸粉，10 g/L；工業蛋白胨， 20 g/L；MgSO4·7H2O， 1 g/L；KH2PO4，0.5 g/L；FeSO4·7H2O， 2 g/L。121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 流加補料策略 流加速率以及通風量和攪拌轉速控制策略如表1所示。

發酵過程中溫度控制在30 ℃，用10%硫酸和10%氨水(均為體積分數，下同)控制pH值在4.8～5.0范圍。

補料策略1：糖蜜(約含30%可發酵性糖)1 300 mL。

補料策略2：糖蜜650 mL+200 g甘油，水定容至1 300 mL。

補料策略3：糖蜜650 mL+200 g甘油+2.4 mg生物素，水定容至1 300 mL。

補料策略4：糖蜜650 mL+250 g甘油+3 mg生物素，水定容至1 300 mL。

補料策略5：糖蜜800 mL+300 g甘油+4 mg生物素，水定容至1 300 mL。

1.1.4 儀器 高壓滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DZF-6020電熱鼓風干燥箱，重慶銀河實驗儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；TG18M臺式高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B恒溫搖床，天津市歐諾儀器儀表有限公司；CJ-1D潔凈工作臺，天津市泰斯特儀器有限公司；容聲BCD-560WD11HY對開門冰箱，海信容聲冰箱有限公司；pH計，賽默飛世爾科技有限公司；高效液相色譜U3000，安捷倫公司；10 L發酵罐，上海聯環生物工程設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種子培養方法 將斜面菌種用接種環勾出一環在新鮮斜面培養基上劃滿整個表面，30 ℃培養12 h；再向培養好的斜面中每支倒入15 mL無菌水洗脫表面菌體，并用移液槍吹打均勻成菌懸液，然后用移液槍轉接至三角瓶，每瓶接種量為10%(5 mL菌懸液)，放置搖床180 r/min，溫度30 ℃培養10 h。

1.2.2 酵母胞內谷氨酸測定 樣品預處理：取發酵液2.5 mL，6500 r/min離心5 min倒掉上清水洗菌體2次，再用5 mL去離子水重懸菌體，-20℃凍1 h，80 ℃水浴15 min，反復凍融3次[15]。凍融好的菌懸液6500 r/min離心5 min取上清600 μL于2 mL離心管再向其中加入2倍體積(1.2 mL)冰凍后的無水乙醇，10 000 r/min，4 ℃離心5 min，用1 mL的注射器和0.22 μm的濾頭過濾上清于樣品瓶，-20℃下保存。胞內游離谷氨酸含量采用HPLC檢測[16]。

HPLC分析條件：色譜柱為安捷倫 ZORBAX SB-Aq column(150 mm×4.6 mm×5 μm，Aglient，USA)；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；紫外檢測波長210 nm；采用10 M pH 1.8的K2HPO4(磷酸調pH)作為流動相；流速0.6 mL/min。根據所測標品，谷氨酸的保留時間為4.6 min。

1.2.3 菌體干重測定 取發酵液2.5 mL，6500 r/min離心5 min，倒掉上清水洗菌體2次，放置在80 ℃的烘箱連續烘干24 h，取出放入干燥器冷卻后稱質量。

1.2.4 總糖測定方法 總糖濃度測定采用硫酸蒽酮法[17]。

1.3 數據處理

所有試驗數據至少3個平行試驗平均值。采用origin 8.5和Excel 2003對試驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 補料策略1對酵母產胞內谷氨酸發酵過程的影響

根據1.1.3的補料控制參數，在3～14 h(圖1中用箭頭標出)流加1 300 mL糖蜜。該補料策略對酵母產胞內谷氨酸、菌體生長的影響如圖1所示。

圖 1 10 L罐上補料策略1對釀酒酵母J-5發酵的影響

由圖1可知，酵母生物量一直處于增長狀態，在24 h達到峰值38.8 g/L；0～3 h發酵過程，碳源被快速利用，伴隨著乙醇大量的生成，胞內谷氨酸呈先降后升趨勢，在3～14 h補料期間，乙醇一直維持在19 g/L左右，此期間胞內谷氨酸在5 h有一個峰值1.78%，之后一直緩慢下降，直到補料結束；總糖消耗至6 g/L左右，乙醇被重新利用，胞內谷氨酸呈先增后降趨勢，在18 h達到峰值2.28%。補料期間隨著流加糖蜜體積的增加，菌體快速增長，但總糖一直處于緩慢增長狀態，同時乙醇一直維持在高位狀態，而胞內谷氨酸呈緩慢下降趨勢，說明酵母生長代謝過程中Crabtree效應明顯，生成的丙酮酸大部分進入乙醇合成途徑；后期碳源不足，乙醇被重新利用時胞內谷氨酸才有所增長，表明發酵過程中削弱Crabtree效應對釀酒酵母胞內谷氨酸合成有利。因此，后續實驗考慮調整碳源組成來控制Crabtree效應。

2.2 補料策略2對酵母產胞內谷氨酸發酵過程的影響

釀酒酵母可以利用甘油做碳源[10]，那么，用遲效碳源甘油替代部分糖蜜能否減弱Crabtree效應？按補料策略2試驗，該補料模式對酵母產胞內谷氨酸、菌體生長和主要代謝的影響如圖2所示。

圖 2 10 L罐上補料策略2對釀酒酵母J-5發酵的影響

由圖2可知，整個發酵周期酵母菌體一直在增長，在發酵結束時達到峰值35.36 g/L，其生長速率和生物量都要低于圖1，0～3 h總糖、乙醇和胞內谷氨酸變化趨勢與圖1相同，而在補料期間，乙醇則處于下降趨勢，由20 g/L降至7 g/L，隨后維持在9 g/L左右，直到21 h再次被利用；補料期間胞內谷氨酸3～9 h呈增長趨勢達到一個峰值2.19%，之后緩慢下降，這與總糖的變化有關，總糖在補料期間幾乎未利用，酵母生長及胞內谷氨酸合成的所需碳源大部分來源于乙醇，因而胞內谷氨酸在9～14 h未繼續增長反而下降了；直到補料結束，酵母為維持生長和合成谷氨酸，碳源才被再次消耗，后續胞內谷氨酸有一個小幅度增長，達到2.37%，比圖1中的峰值2.28%提高了約4%。但碳源的利用率明顯不足，直到發酵結束總糖濃度有40 g/L左右。由此可知，用甘油替代糖蜜雖然減弱了Crabtree效應，但也使得碳源利用率顯著降低，推測原因可能是由于甘油替代了糖蜜，而替代糖蜜中所含的生物素并沒有及時補加，這樣使得補料組分中的生物素不足。適量的生物素可通過丙酮酸羧化酶固定CO2提高進入三羧酸循環的碳通量[18]，而且還能促進碳代謝由異檸檬酸流向谷氨酸[14]。因此，考慮后續實驗在此基礎上添加生物素，以考察其對酵母產胞內谷氨酸、菌體生長和主要代謝的影響。

2.3 補料策略3對酵母產胞內谷氨酸發酵過程的影響

通過折算被替代糖蜜中的生物素含量，在補料成分中添加生物素，具體按補料策略3試驗，該補料模式對酵母產胞內谷氨酸、菌體生長和主要代謝的影響如圖3所示。由圖3可知，發酵過程中酵母生長趨勢與圖2一致，但酵母的生長速率明顯有所提高，在24 h達到峰值39.18 g/L，比35.36 g/L提高10.8%；0～3 h各項指標變化趨勢與前兩批一致；補料期間，乙醇趨勢與圖2一致，由20 g/L降至10 g/L并維持，補料結束后再次被利用；補料期間胞內谷氨酸呈增長趨勢，在12 h達到峰值2.82%，比圖1和圖2中的峰值分別提高約23.7%和19%，之后緩慢下降，在此期間總糖的利用率明顯提高，未出現隨補料體積增加而急劇增加的情況，同時發酵結束時總糖僅維持在5 g/L左右。說明：在甘油替代部分糖蜜的基礎上，添加一定量的生物素，既能緩解Crabtree效應，使胞內谷氨酸含量明顯提高，又可以提高甘油+糖蜜的利用率。因此，猜想在后續實驗中增加甘油的比例，同時按策略3中甘油與生物素的比例，相應增加生物素的量，可能會使Crabtree效應更弱，從而進一步提高胞內谷氨酸含量。

圖 3 10 L罐上補料策略3對釀酒酵母J-5發酵的影響

2.4 補料策略4對酵母產胞內谷氨酸發酵過程的影響

甘油替代部分糖蜜的同時添加生物素確實能減弱Crabtree效應，說明調整碳源組成是有效的，那么，增加甘油的比例能否進一步減弱Crabtree效應呢？因此按補料策略4試驗，該補料模式對酵母產胞內谷氨酸、菌體生長和主要代謝的影響如圖4所示。由圖4可知，酵母在整個發酵周期一直呈增長趨勢，在發酵結束時達到峰值39.22 g/L，生物量與圖3基本一致；整個發酵過程中乙醇、總糖和胞內谷氨酸的變化趨勢與圖3高度相似，這也再次證明用甘油替代糖蜜的同時添加相應的生物素既減弱了Crabtree效應，又提高了碳源的利用率；雖然胞內谷氨酸在13 h達到峰值2.89%，比圖1和圖3中的峰值分別提高了約26.7%和2.5%，但補料期間的乙醇并未如2.3中的猜想那樣降至更低水平，而且補料結束之后，胞內谷氨酸依然呈下降趨勢。這表明提高補料組分中甘油的比例并沒有進一步減弱Crabtree效應，補料期間胞內谷氨酸的略微提高可能與增加了碳源(甘油)有關；后期胞內谷氨酸的下降情況說明發酵后期碳源不足。因此，考慮后續實驗中增加補料組分中糖蜜和甘油的量，研究其能否進一步提高胞內谷氨酸或使發酵后期胞內的谷氨酸含量處于維持狀態。

圖 4 10 L罐上補料策略4對釀酒酵母J-5發酵的影響

2.5 補料策略5對酵母產胞內谷氨酸發酵過程的影響

為了進一步提高胞內谷氨酸含量和維持發酵后期胞內谷氨酸的水平，提高了補料成分中糖蜜和甘油的量，具體按補料策略5試驗。該補料模式對酵母產胞內谷氨酸、菌體生長和主要代謝的影響如圖5所示。

圖 5 10 L罐上補料策略5對釀酒酵母J-5發酵的影響

由圖5可知，在該條件下發酵，菌體的生長和主要代謝參數變化與2.4相似，這同樣驗證了甘油和生物素所產生的作用；生物量在發酵結束達到峰值38.72 g/L，補料期間的乙醇下降后維持在11 g/L左右，胞內谷氨酸呈上升趨勢在12 h達到峰值3.04%，比圖4和圖1的峰值分別提高了5.2%和33.3%，雖然胞內谷氨酸相較2.4有略微提高，但后期還是未處于維持狀態。從后期總糖和乙醇的量來分析，可能發酵過程中流加的碳源仍然不足，使得發酵后期菌體生長不得不利用谷氨酸作碳源，因此，后期胞內谷氨酸呈下降趨勢。

2.6 種補料策略的比較

由表2可知，對比策略1和策略2各項參數，發現甘油替代糖蜜能減弱了Crabtree效應，讓乙醇濃度降低，但也使得碳源利用率顯著降低，發酵結束時殘糖維持在高水平(40 g/L)，生物量峰值有所降低；而后續3種策略，生物素的添加，既讓Crabtree效應減弱，又顯著提高了碳源利用率，生物量峰值回升，同時胞內谷氨酸含量明顯提高(由2.28%增長至3.04%)，發酵周期也縮短了約6 h。

表2 5種補料策略的比較

3 結論

針對釀酒酵母發酵產胞內谷氨酸的過程中，流加糖蜜使Crabtree效應明顯、胞內谷氨酸產量低的問題，本研究通過改變發酵過程中補料成分的組成，流加混合成分(糖蜜800 mL，300 g甘油，4 mg生物素，體積加水補至1300 mL)顯著提高了胞內谷氨酸的含量，其峰值達到3.04%(12 h)，相較于發酵過程中只流加1300 mL糖蜜時的峰值2.28%(18 h)提高了33.3%，縮短了發酵周期約6 h。研究結果顯示，在甘油替代糖蜜的基礎上添加相應質量的生物素能夠顯著減弱Crabtree效應，提高胞內谷氨酸的含量。綜上所述，在補料成分中添加甘油和生物素是減弱Crabtree效應、提高胞內谷氨酸含量的有效方式之一。

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[責任編校： 張 眾]

Effects of Glycerol and Biotin additions on intracellular Glutamate Production by Saccharomyces cerevisiae

LIU Licong1，TANG Chao1，WANG Zhi1，DAI Jun1，LI Xin1， YAO Juan2，ZHENG Guobin1, LYU Zhengbo3， CHEN Xiong1

(1KeyLaboratoryFermentationEngin. (MinistryofEducation),HubeiProvincialCooperativeInnovationCenterofIndustrialFermentation,CollegeofFoodandBioengin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China; 2HubeiProvincialKeyLaboratoryofYeastFunction,AngelYeastCo.,Ltd,Yichang443003,China; 3.AngelYeast(DeHong)Co.,Ltd,Dehong678400.China)

In order to reduce the Crabtree effect and increase the intracellular glutamate production by Saccharomyces cerevisiae, the growth and metabolism of Saccharomyces cerevisiae has been studied under three conditions: pure molasses addition, molasses addition with glycerol, molasses addition plus glycerol with biotin. The results show that the molasses addition, partly substituted by glycerol, can reduce the Crabtree effect, but the carbon source utilization rate has significantly decreased. Molasses addition plus glycerol with biotin batch culture has reduced not only the Crabtree effect, but also resolved the problem of a low carbon source utilization rate by molasses addition with glycerol batch culture. When the fed batch culture was done with molasses (800 mL) as well as glycerol (300 g) and biotin (4 mg), the intracellular glutamate content reached 3.04% at 12 h, which was 33.3% higher than that of the pure molasses 2.28%(18 h), and the fermentation period was shortened by 6 h.

Crabtree effect;Saccharomycescerevisiae; glycerol; biotin; intracellular glutamate

2017-03-06

劉立聰(1991-)， 男， 湖北洪湖人，湖北工業大學碩士研究生，研究方向為發酵工程

陳 雄(1969-)，男，湖北荊門人，工學博士，湖北工業大學教授，研究方向為釀造工程

1003-4684(2017)02-0042-05

Q815

A