寧波地區非綜合征型耳聾患兒耳聾基因熱點突變篩查分析

高薇薇 盧文翔 張雷 白云飛

寧波地區非綜合征型耳聾患兒耳聾基因熱點突變篩查分析

高薇薇 盧文翔 張雷 白云飛

目的 篩查分析寧波地區非綜合型耳聾(NSHL)患兒耳聾基因熱點突變情況，了解該地區耳聾患兒分子流行病學特征。方法 選取寧波市特殊教育中心就讀的重度、極重度NSHL患兒168例，應用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，采用多重突變阻滯擴增系統毛細管電泳檢測技術進行4個遺傳性耳聾基因的29個位點的突變篩查。 結果 本研究NSHL患兒中檢出耳聾基因熱點突變58例（34.52%），其中單一GJB2基因熱點突變者43例，單一SLC26A4基因熱點突變者9例，GJB2基因合并SLC26A4基因熱點突變者3例，12S rRNA基因熱點突變3例；GJB2、SLC26A4、12S rRNA基因熱點總突變率分別為27.38%、7.14%和1.79%。在所有熱點突變中，以GJB2 235delC突變率最高（23.21%），其次是GJB2 299 del AT（5.36%）。 結論 寧波地區NSHL患兒熱點突變耳聾基因以GJB2基因和SLC26A4基因為主，且GJB2 235delC是最常見突變位點。

遺傳性耳聾 非綜合征型耳聾 熱點突變 基因診斷

我國每年患各種出生缺陷和先天殘疾的新生兒中，聽力殘疾是最常見，也是最嚴重的，其中遺傳因素導致的聽力殘疾超過半數。遺傳性耳聾按表型不同可分為綜合征型耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）。NSHL是指只有聽力損害，不伴有耳外組織的異常和病變，約占遺傳性耳聾的70%。國內大規模的耳聾分子流行病學調查顯示，在NSHL患者中存在幾個熱點突變：GJB2基因突變、GJB3基因突變、線粒體12S RNA和SLC26A4基因突變[1]。這些熱點突變的發現為我國開展耳聾基因突變的篩查、診斷及阻斷提供了理論基礎。本研究對寧波地區NSHL患兒進行了4個遺傳性耳聾基因的29個位點的突變篩查，以了解該地區NSHL患兒耳聾基因熱點突變譜系及發生頻率，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年7月至2016年12月在寧波市特殊教育中心及其附屬幼兒園（鄞州區小雨點聽力語言康復中心）就讀的具有完整聽力學資料的重度、極重度耳聾患兒168例，排除各類SHL及急慢性中耳炎、聽神經性瘤、耳外傷等有明顯原因致聾的患兒。經問卷調查及體格檢查，全部患兒為NSHL，其中男87例，女81例；年齡3～16（11.22±4.10）歲。本研究患兒均接受了耳聾基因檢測，并取得患兒及患兒家長的知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 AGCU遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（無錫中德美聯生物技術有限公司），磁珠法DNA提取試劑盒（長春市博坤生物科技有限公司），去離子甲酰胺（美國ABI公司），POP4膠（美國ABI公司），Life Pro擴增儀（杭州博日科技有限公司），3130XL型遺傳分析儀（美國ABI公司）。

1.2.2 DNA樣本的采集 先在干凈的15ml離心管上空白位置和管蓋上作好耳聾患兒代號標記。耳聾患兒在取樣前30min內停止進食。采樣人員用消毒棉簽輕輕刮取患兒口腔舌下及雙側頰黏膜口腔上皮細胞，輕輕地旋轉或刮動10次左右以保證獲得足夠的DNA，采集過程中注意避免用手觸及棉簽；采集完成后置于空氣中風干片刻，再放回離心管并封口。

1.2.3 檢測方法 采用磁珠法提取DNA。每例棉簽樣本用小剪刀剪取少量，可被150μl裂解液淹沒即可，提取的DNA直接用于PCR擴增。PCR擴增體系組成：Reaction Mix 5.0μl+Primers 2.0μl+熱啟動C-Taq酶0.3μl+模板（磁珠法提取）1.0μl+sdH2O 1.7μl。PCR擴增程序：預變性95℃5min，94℃1min、60℃1min、72℃1min（循環30次），終延伸72℃20min。

1.2.4 熱點突變篩查 采用多重突變阻滯擴增系統毛細管電泳檢測技術篩查。取1μl PCR產物與10μl去離子甲酰胺和AGCU Marker SIZ-500混合物混勻，采用3130XL型遺傳分析儀檢測（進樣電壓3KV，時間10s），結果采用GeneMapper v3.2軟件進行分析。篩查4個遺傳性耳聾基因的29個位點的突變，包括GJB2基因（9、35、167、176、235、299、155、424、512）、GJB3基因（538、547）、SLC26A4基因（281、589、707、IVS7－2、1174、1226、1229、1238、1336、1548、1829、1975、IVS15+5、2027、2168）和12S rRNA基因（1494、1555、12201）。

2 結果

2.1 168例NSHL患兒耳聾基因熱點突變分析 本研究NSHL患兒中檢測到耳聾基因熱點突變者58例（34.52%），其中單一GJB2基因熱點突變者43例，單一SLC26A4基因熱點突變者9例，GJB2基因合并SLC26A4基因熱點突變者3例，12S rRNA基因熱點突變3例。GJB2基因熱點總突變率為27.38%（46/168），SLC26A4基因熱點總突變率為7.14%（12/168），12S rRNA基因熱點總突變率1.79%（3/168）。在上述所有熱點突變中，GJB2 235delC突變率最高，為23.21%（39/168）；其次是GJB2 299 del AT，為5.36%（9/168）；SLC26A4 1226G＞A、2168A＞G以及12S rRNA 1555A＞G突變率均為1.79%（3/168）；本研究患兒未檢出GJB3基因突變。168例NSHL患兒耳聾基因熱點突變分析見表1。

表1 168例NSHL患兒耳聾基因熱點突變分析

2.2 58例耳聾基因突變NSHL患兒突變熱點分析 由表2可見，46例GJB2基因熱點突變NSHL患兒中GJB2基因單個熱點突變的患者39例，分別為235delC純合突變21例，235delC雜合突變11例，299-300delAT雜合突變5例，176del16雜合突變1例，35delG雜合突變1例；GJB2基因2個突變熱點的患者4例，分別是299delAT/235delC復合雜合突變3例，176del16、235delC復合雜合突變1例；GJB2基因與SLC26A4基因復合突變的患者3例，分別是GJB2 235delC純合突變合并SLC26A4 1180delTTC雜合突變1例，GJB2 235delC雜合突變合并SLC26A4 2168A＞純合突變1例，GJB2 299delAT/235delC雜合突變合并SLC26A4 2168A＞G雜合突變1例。

12例SLC26A4基因熱點突變NSHL患兒中，與GJB2基因復合突變3例，SLC26A4基因單一熱點突變9例：919A＞G純合突變1例，1975G＞C純合突變1例，雜合突變1例，1226G＞A雜合突變3例，2168A＞G雜合突變1例，1229C＞T雜合突變2例。

3例 12S rRNA基因熱點突變 NSHL患兒中，1555A＞G均質性突變2例，1555A＞G異質性突變1例。其中2例1555A＞G均質性突變患兒為出生后用藥致聾，另1例異質性突變患兒為先天性聾。

表2 58例耳聾基因突變NSHL患兒突變熱點分析（例）

3 討論

遺傳因素能夠影響耳聾的發生、發展，通過確定耳聾患者及高危人群的遺傳因素，給予正確的指導及干預措施，可一定程度上預防耳聾新發及加重。目前發現的耳聾基因眾多，突變譜廣泛，國內NSHL患者耳聾基因熱點突變的確定為尋找國內多數NSHL的病因指明了方向。

GJB2基因突變會導致耳蝸中的細胞縫隙連接中斷，導致聽覺功能失常。目前約有50%的常染色體隱性遺傳NSHL存在該基因耳聾突變[2]。GJB2基因突變導致的聽力損失多表現為先天性、雙側對稱性、非進行性重度或極重度耳聾。GJB2基因的突變幾乎覆蓋整個編碼區，其突變位點具有明顯的種族差異性，歐美人群中GJB2基因突變最多見為30delG或 35delG的熱點突變[3]，紀育斌等[4]2011年通過對國內GJB2基因突變流行病學文獻的薈萃分析認為國內GJB2總體致病突變率為12.88%，總體突變率為19.41%。彭新等[5]報道揚州地區278例NSHL的GJB2基因突變率為31.7%，致病突變率為23.4%。張迪等[6]報道內蒙古自治區355例NSHL患者GJB2基因突變率為14.93%；GJB2基因具有多種突變方式，國內多項耳聾分子流行病學調查研究表明，GJB2基因以235delC突變最常見，其次為 299delAT、176del 16，而35delG突變少見。戴樸等[7]對1 680例NSHL患者進行耳聾分子流行病學研究，發現GJB2 235delC突變率較高，為18.16%。于飛等[8]研究提示國內不同地區NSHL患者235delC突變率為6.59%～25.18%。楊雪等[9]報道貴州省356例NSHL患者GJB2基因最常見突變位點是235delC。本研究結果顯示，寧波地區NSHL患兒GJB2基因致病突變率為13.01%（22/168），突變率為27.38%（46/168），表明寧波地區耳聾基因突變以GJB2突變最普遍；本研究結果顯示235delC突變率最高，為23.21%，突變率明顯高于GJB2其他位點，其中純合突變有22例，雜合突變有17例，說明235del也是寧波地區NSHL患兒中最常見的突變位點。

SLC26A4基因突變可引起NSHL及SHL。在NSHL中，SLC26A4基因與常見的一種內耳畸形-大前庭導水管綜合征的發病有直接因果關系，國內各地區有關SLC26A4基因突變率的報道并不一致：梁鵬飛等[10]報道陜西省 800例NSHL患者SLC26A4基因突變率為18.88%；劉水霞等[11]報道廣西地區127例NSHL患者SLC26A4基因突變率為2.36%；牟書瑜等[12]報道大連地區5 266例耳聾患者中SLC26A4基因突變率為9.72%。不同種族人群中SLC26A4基因突變譜不同，國內SLC26A4基因突變熱點主要是IVS7-2A＞G：袁永一等[13]對國內2 352例重度、極重度耳聾人群進行了SLC26A4基因全序列分析，發現IVS7-2A＞G位點突變率達到11.52%；何本超等[14]對湖北天門市52例聾啞兒童基因檢測發現SLC26A4基因突變率為17.30%，以IVS7-2A＞G位點突變最為常見。本研究結果顯示SLC26A4基因熱點突變率為7.14%（12/168），其中純合突變3例，分別是1975G＞C、919A＞G和2168A＞G，此3例患兒臨床診斷均為大前庭導水管綜合征，其它熱點突變為雜合突變，分別為1975G＞C、2168A＞G、1226G＞A和1229C＞T，并未發現國內報道最多的IVS 7-2 A＞G突變。除了選擇對象的不同，推測可能確實存在地區間的差異。受實驗條件限制，由于此基因的遺傳特性，雙等位基因突變可以導致耳聾表型的發生，對單雜合突變和復合雜合突變的耳聾患者，檢測結果受目前耳聾基因突變位點數目及種類的限制，不能檢出全部已知SLC26A4基因突變位點，所以SLC26A4基因單雜合突變患者應進一步做基因測序明確病因。

線粒體12S rRNA基因突變跟母系遺傳有關，該突變攜帶者應用氨基糖苷類藥物可造成不可逆的聽力損害。目前，mtDNA12S rRNA A1555G點突變導致的藥物性耳聾已成為公認的突變致聾位點，紀育斌等[15]綜合16篇研究對象為NSHL患者的文獻數據，初步得出中國患者A1555G突變率為6.62%（230/3473）。本研究結果顯示12S rRNA突變率為1.79%（3/168），低于國內其他報導，其中2例為1555 A＞G均質性突變，此2例患兒均為出生后用藥致聾；另1例為異質性突變，該患兒致聾病因與其有一定相關。目前在對這3個患兒母系家庭成員進行相關調查，擬行基因突變的篩查，找出攜帶該基因突變的氨基糖苷類藥物敏感聽力正常個體，通過科普宣教、指導用藥、遺傳咨詢、產前診斷等干預措施，能阻斷該基因突變在此類家族中繼續傳遞。

總之，耳聾基因熱點突變篩查對于耳聾阻斷意義重大。對多數耳聾患者可以從分子學進行診斷，利用基因快速檢測技術篩查耳聾人群和突變基因攜帶者，通過產前診斷技術預防后代耳聾的發生。

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Screening of hot-spot deafness gene mutations among children with non-syndromic hearing loss in Ningbo region

GAO Weiwei,LU Wenxiang,ZHANG Lei,et al.Ningbo College of Health Sciences,Ningbo 315800,China

Hereditary hearing loss Non-syndromic hearing loss Hot-spot mutation Genetic diagnosis

2017-03-19）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2017-595

浙江省教育廳科研項目（Y201534685）

315100 寧波衛生職業技術學院（高薇薇）；無錫中德美聯生物技術有限公司研發部（盧文翔）；浙江大學明州醫院耳鼻咽喉科、浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院耳鼻咽喉頭頸外科（張雷）；東南大學分子電子學國家重點實驗室（白云飛）

高薇薇，E-mail：wiwi_g@163.com

【 Abstract】 Objective To screen the hot-spot deafness gene mutation in children with non-syndromic hearing loss (NSHL)in Ningbo region. Methods One hundred and sixty eight NSHL children were enrolled from Ningbo Special Education Center for the study.The screening of 29 hot-spot mutations of 4 deafness genes was performed by multiple ARMS capillary electrophoresis using AGCU genetic deafness gene detection kit. Results Among 168 children,the deafness gene mutations were detected in 58 cases (34.52%),including 43 cases with single hotspot mutation in GJB2 gene,9 with hotspot mutations in single SLC26A4 gene,and 3 with GJB2 gene and SLC26A4 gene mutation,and 3 with 12S rRNA gene mutation.The total hot spot mutation rate of GJB2 gene was 27.38%,that of SLC26A4 gene was 7.14%,and that of 12S rRNA gene was 1.79%.The mutation rate of GJB2 235delC was the highest(23.21%),followed by GJB2 299 del AT(5.36%)in all hotspots. Conclusion GJB2 and SLC26A4 are the main genes associated with non-syndromic deafness patients in Ningbo area,and GJB2 235delC is the most common mutation site.