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目的探討microRNA-616（miR-616）在肝細胞癌（HCC）中的表達及其在HCC侵襲轉移中的作用機制。方法通過qRT-PCR檢測miR-616在60例HCC及癌旁組織中的表達，同時檢測miR-616在不同肝癌細胞系中的表達情況；免疫組織化學染色檢測miR-616在HCC及癌旁組織中波形蛋白（vimentin）、上皮型鈣黏素（E-cadherin）及同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）的表達情況；qRT-PCR檢測miR-616在人正常永生化肝細胞（LO2）及5種不同肝癌細胞系（HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Hu7）中的表達水平；使用miR-616抑制物作用Hep3B細胞，TranswellTM實驗檢測miR-616抑制后Hep3B細胞侵襲能力變化；應用miR-616抑制物及PTEN siRNA轉染Hep3B細胞，qRT-PCR檢測Hep3B中miR-616、vimentin、PTEN、E-cadherin的mRNA水平，Western blot法檢測癌細胞中vimentin、PTEN、E-cadherin的蛋白水平。結果 miR-616在HCC組織中表達水平高于對應癌旁組織；miR-616在不同肝癌細胞系中表達均高于LO2細胞；miR-616高表達與低表達在血管侵犯、Edmonson-Steiner分級、TNM分期比較差異均有統計學意義(均P＜0.05)；miR-616高表達肝癌組PTEN及E-cadherin水平低于miR-616低表達肝癌組，而vimentin水平高于miR-616低表達肝癌組，相關性分析結果顯示HCC組織中miR-616與E-cadherin、PTEN水平呈負相關，與vimentin水平呈正相關；在肝癌細胞中抑制miR-616后PTEN及E-cadherin表達水平上調，而vimentin表達降低，Hep3B細胞的侵襲能力明顯降低。結論 miR-616在HCC組織中表達上調，其表達與HCC惡性臨床病理特征有關，miR-616促進肝癌細胞侵襲轉移的作用可能與其抑制PTEN表達及誘導上皮間質轉化有關。

miR-616 肝細胞癌侵襲靶基因同源性磷酸酶-張力蛋白上皮間質轉化

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of miR-616 in human hepatocellular carcinoma and its effects on tumor invasion and metastasis. Methods The expression of miR-616 was detected with real-time quantitative PCR(qRT-PCR) in 60 specimens of hepatocellular carcinoma (HCC)tissues and corresponding adjacent normal tissues;and also in human HCC HepG2,SMMC-7721,Hep3B,Hu75 cells and normal liver LO2 cells.The expression of vimentin,phosphatase,tensin homolog (PTEN)and E-cadherin was detected with immunohistochemical S-P method.The miR-616 inhibitor was transfected into Hep3B cells in vitro,cell invasion was analyzed by Transwell?assay.The expression of PTEN,E-cardhern and vimentin mRNAs and proteins after transfection was detected by qRT-PCR and Western blotting,respectively. Results The expression of miR-616 in HCC tissues was higher than that in matched tumor-adjacent normal tissues;and it was significantly correlated with venous infiltration,high Edmondson-Steiner grades and lymph node metastasis and TNM tumor stages in HCC.Elevated miR-616 expression was observed in HCC cell lines HepG2,SMMC-7721,Huh7 and Hep3B as compared with that in LO2 hepatic cell line.Furthermore,miR-616 expression was negatively correlated with E-cadherin and PTEN,positively correlated with vimentin in HCC tissues.The miR-616 inhibitor suppressed the migration and invasion in Hep3B cells;and it increased the expression of E-cadherin and PTEN,while decreased the expression of vimentin in Hep3B cells.In addition,down-regulation of PTEN' expression partially abrogated the effect of miR-616 inhibitor in HCC cells. Conclusion The expression of miR-616 in HCCtissues is significantly up-regulated,and it can promote proliferation and induce apoptosis of HCC cells by down-regulating the expressions of PTEN.

【 Key words】 microRNA-616 Hepatocellular carcinoma Migration and invasion Phosphatase and tensin homolog (PTEN) Epithelial-mesenchymal transition

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其已成為亟待解決的醫學界問題[1]。目前在世界范圍內HCC的治療取得了一定的進展[2]，但是HCC發生、發展的具體分子機制仍不十分清楚。微小RNA（microRNA）是一類由18～25個核苷酸構成的小分子非編碼RNA，microRNA可與靶基因mRNA的3′端非編碼區（3′UTR）互補結合，下調靶基因的表達水平[3]。許多microRNA已被證實在HCC中異常表達，在腫瘤侵襲、轉移及發生、發展中起到重要作用[4－6]。mircoRNA－616（miR－616）是近期發現新的癌癥相關mircoRNA。有研究發現miR－616在胃癌組織中過表達[7]，在肺癌和前列腺癌患者的血清中顯著升高[8－9]。但其在HCC中的表達及作用機制尚不明確。筆者通過檢測miRNA－616與上皮間質轉化（EMT）相關標志物及其潛在靶基因同源性磷酸酶－張力蛋白（PTEN）在HCC組織中的表達情況，應用人工合成的miR－616抑制物及PTEN siRNA轉染HCC Hep3B細胞，研究miR－616在HCC侵襲、轉移及發展中的作用，為HCC的診斷及生物治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料本課題經過西安交通大學醫學院附屬第一醫院倫理審核批準，收集2014年9月1日至2015年8月30日期間于西安交通大學醫學院附屬第一醫院普外科行外科手術切除的60例患者的肝癌組織和其相對應的癌旁組織（距切緣＞2cm）標本，年齡25～64歲，中位年齡49歲。所有患者均知情同意，并簽署相關文件，納入標準為所有患者手術前均未行生物靶向治療及放化療。組織標本離體20min內取材，共2份，分別置入液氮或甲醛溶液中保存。LipofectamineTM2000及TRIzol試劑采購于Invitrogen公司；real－time PCR試劑盒（Super－Real PreMix，SYBRRGreen，FP204）及mRNA逆轉錄試劑盒（Quant Reverse Transcriptase，ER103）采購于自北京天根生化科技有限公司；miR－616引物、RNU6B引物、miR－616抑制物及抑制物相應陰性對照均購自中國GeneCopoeia公司；PTEN siRNA（上游引物：5′－AACCCACCACAGCUAGAACTT－3′），空白對照siRNA（上游引物：5′－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3′）由上海生工生物科技有限公司合成；1×DMEM細胞培養液采購于Mediatech公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于美國Gibco公司；人正常永生化肝細胞（LO2）及肝癌細胞系（HepG2、SMMC－7721、Hep3B、Hu7）購于中科院上海生物化學與細胞生物研究所；TranswellTM小室試劑盒購于瑞士Roche公司；兔抗人PTEN抗體及兔抗人E－cadherin抗體購于英國Abcam公司，小鼠抗抗人vimentin抗體人及小鼠β－actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；生物素標記的山羊抗小鼠 IgM（A2086），小鼠抗兔IgG（211－065－109）購于中國愛美捷科技有限公司。

1.2.1 qRT－PCR檢測肝癌組織、相應癌旁組織、LO2及肝癌細胞系中miR－616 mRNA的水平[4]按TRIzol試劑說明書提取肝癌組織、相應癌旁組織、LO2及肝癌細胞系（HepG2、SMMC－7721、Hep3B、Hu7）總RNA。按逆轉錄試劑盒說明書設置：2×SuperReal Premix 12.5μl；無RNase雙蒸水9μl；上、下游引物（10μmol/L）各0.75μl。按如下條件進行PCR反應：94℃預變性10min，94℃變性10s，57℃退火、延伸30s，擴增35個循環，擴增結束后制作熔解曲線。內參為RNU6B，采用2－△△Ct法計算miR－616 mRNA相對表達量，同一個樣本獨立重復進行3次實驗。

1.2.2 免疫組織化學染色檢測HCC組織中PTEN、E－cadherin及vimentin表達水平[4]HCC組織標本進行脫水后石蠟包埋，4μm切片。切片在脫蠟水化后于枸櫞酸緩沖液（pH6.0）中進行抗原熱修復；H2O2溶液（30ml/L）作用切片后，山羊血清封閉后PBS溶液稀釋的1∶500的PTEN抗體、vimentin抗體、E－cadherin抗體4℃孵育8～12h；然后小鼠抗兔IgG及山羊抗小鼠IgM在37℃下孵育50min；洗滌后滴加辣根過氧化物酶－鏈酶卵白素復合物進行反應，DAB顯色后進行蘇木素復染，常規脫水透明，中性樹膠封片。每張切片經由2位高年資病理醫師，在高倍鏡（×400）下隨機選取10個視野，按文獻[10]所述的標準評分。最終評分≥1分者為蛋白陽性表達。

1.2.3 肝癌細胞培養及轉染[4]Hep3B細胞培養于含FBS的1×DMEM細胞培養液中，37℃、50ml/L CO2培養箱中培養。傳代穩定2～3代后，取對數生長期Hep3B細胞接種于6孔板中，每個孔里加入含FBS的1×DMEM細胞培養液培養，使細胞至匯合度達70%。實驗組每孔加入5μlLipofectamineTM2000及150pmol/LPTENsiRNA；對照組每孔加入 5μl LipofectamineTM2000及 150pmol/L Control siRNA。再加入不含血清的DMEM培養基調整終體積至2ml，置于37℃、50ml/L CO2的培養箱中培養6h，更換完全培養基繼續培養[4]。

1.2.4 細胞侵襲能力檢測將TranswellTM小室放入24孔板中，上室加入300μl預溫的無血清DMEM培養基，室溫靜置20min后吸去剩余培養液。消化后的Hep3B細胞調整細胞數至1×105～10×105個/ml，取細胞懸液150μl加入TranswellTM小室，常規培養48h后，用刀片沿小室邊緣將膜切下，膜片倒置于24孔板的孔中，甲醇：冰醋酸（濃度比例3∶1）固定8min，Giemsa染色，鏡下檢測細胞數，每個樣本獨立重復實驗3次[4]。

1.2.5 Western blot法檢測 PTEN、E－cadherin及 vimentin的表達[4]收集轉染72h后的Hep3B細胞，RIPA裂解液置冰上裂解 10min后 4℃、12 000r/min離心10min取上清液，BCA法測定上清液中總蛋白濃度。每孔加入40μg蛋白樣品，采用100g/L垂直SDS－PAGE分離蛋白，Bio－Rad半干轉印系統，25V轉膜1.5h，BSA室溫封閉1.5h；加入兔抗人PTEN抗體（1∶1 000）、兔抗人E－cadherin抗體（1∶1 000）、小鼠抗人β－actin抗體（1∶2 000）及小鼠抗人vimentin（1∶500）抗體，4℃孵育8h；PBS洗去抗體，分別加入相對應的二抗（1∶4 000），室溫孵育2h；PBS洗滌3次，每次5min，滴加ECL溶液暗室曝光，全自動洗片機進行洗片。

1.3 統計學處理應用SPSS16.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，采用Pearson χ2檢驗分析miR－616表達與臨床病理資料間關系，Spearman相關分析miR－616與PTEN、vimentin及E－cadherin相關性。

2 結果

2.1 miR－616肝癌組織及對應癌旁組織、肝癌細胞系中的表達 qRT－PCR結果顯示miR－616在肝癌組織中的表達量明顯高于對應的癌旁組織（P＜0.05），見圖1a；miR－616在侵襲性HCC組織中的表達量顯著高于非侵襲性HCC組織（P＜0.05），見圖1b；miR－616在HepG2、SMMC－7721、Hep3B、Hu7肝癌細胞系中的表達量均明顯高于LO2細胞（均P＜0.05），見圖1c。

圖1 miR-616在肝癌組織、癌旁組織及肝癌細胞系中的表達量[a：miR-616在HCC組織（n=60）和癌旁組織（n=60）中表達量；b：miR-616在侵襲性HCC組織（n=60）及非侵襲性HCC組織（n=60）中的表達量；c：miR-616在4種肝癌細胞系和LO2細胞種的表達量；*P＜0.05]

2.2 miR－616表達與肝癌患者臨床病理特征的關系以miR－616在組織中的中位表達水平（0.47±0.012）%作為分割線，將60例HCC組織劃分為miR－616高表達組30例與miR－616低表達組30例。結果提示miR－616高表達與低表達在血管侵襲、高TNM分期（Ⅲ期和Ⅳ期）和高Edmondson－Steiner分級（Ⅲ期和Ⅳ期）等方面比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 miR－616與PTEN、E－cadherin及vimentin表達的相關性結果顯示，miR－616低表達組中E－cadherin及PTEN表達強度明顯高于miR－616高表達組（P＜0.05），見圖2a－b；而vimentin表達強度明顯低于miR－616高表達組（P＜0.05），見圖2c。Spearman相關分析結果顯示，miR－616與PTEN呈負相關（r=－0.472，P=0.015），與E－cadherin呈負相關（r=－0.5120，P=0.014），與vimentin呈正相關（r=0.539，P=0.041）。

2.4 下調miR－616對肝癌Hep3B細胞侵襲轉移能力的影響結果發現，miR－616抑制劑組細胞較陰性對照組細胞侵襲能力明顯下降（P＜0.05），見圖3。

2.5 miR－616與肝癌細胞中PTEN、E－cadherin、vimentin的關系通過數據庫（Target－Scan 6.2和MiRanDa）預測miR－616的靶基因，發現PTEN可能是miR－616靶基因，如圖4a所示，PTEN的3′－UTR含有miR－616的互補序列。此外，為探討miR－616在肝癌細胞中的可能作用機制，筆者使用miR－616抑制物、siRNA分別及同時轉染Hep3B肝癌細胞后，應用Western blot檢測其下游靶蛋白PTEN、E－cadherin及vimentin水平。結果顯示下調肝癌細胞Hep3B中的miR-616表達水平后，PTEN及E-cadherin表達水平明顯上調，而vimentin表達明顯下降；相比較單獨轉染miR-616抑制物組，同時使用PTEN siRNA及miR-616抑制物轉染Hep3B細胞后，PTEN及E-cadherin表達量明顯增加，而vimentin表達量降低，見圖4b。

圖2 PTEN、vimentin及E-cadherin在不同miR-616水平的肝癌組織表達情況（a：E-cadherin在不同miR-616水平的肝癌組織表達情況；b：PTEN在不同miR-616水平的肝癌組織表達情況；c：Vimentin在不同miR-616水平的肝癌組織表達情況，與miR-616低表達比較，*P＜0.05）

圖 3 miR-616轉染后促進肝癌細胞 Hep3B侵襲轉移（a：qRT-PCR法檢測miR-616抑制劑轉染Hep3B細胞后miR-616水平；b：TranswellTM法檢測miR-616抑制物轉染Hep3B細胞前后細胞侵襲能力變化；Giemsa染色，×200；與對照組比較，*P＜0.05）

圖4 miR-616在Hep3B細胞中調控PTEN、E-cadherin及vimentin的表達情況（a：miR-616與PTEN 3′-UTR的互補序列；b：miR-616抑制物及PTENsiRNA轉染Hep3B細胞對PTEN、E-cadherin及vimentin的表達情況影響）

3 討論

HCC發生、發展是一系列復雜的過程，涉及多個信號通路，其具有早期診斷困難、侵襲能力強和早期發生遠處轉移的特點[11]。流行病學顯示，其病死率居于我國癌癥病死率第2位[11]。因此，尋找新的有效HCC分子標志物及生物治療靶點對肝癌的診療提供了重要的依據。

作為內源性的一類小RNA分子，miRNA可與其靶基因mRNA序列不完全互補結合，形成發卡樣結構，進而抑制靶基因的翻譯，從而調控下游靶基因的表達水平[4，12]。有研究發現miR-616在胃癌[13]、肺癌[8]、前列腺癌[9]中高表達。本研究通過對60例HCC及對應癌旁組織、肝癌細胞系進行檢測，發現在HCC組織中miR-616的表達水平高于對應的癌旁組織，且侵襲性肝癌組織表達量更高。臨床病理資料分析顯示miR-616高表達與HCC血管侵犯、高TNM分期及高Edmondson分級惡性臨床病理特征密切相關。此外通過對HCC細胞系及LO2的檢測發現miR-616在LO2中的表達量也低于肝癌細胞系，在Hep3B細胞中抑制miR-616的表達后Hep3B細胞的侵襲、轉移能力降低。以上結果提示miR-616可能在HCC的侵襲轉移中發揮重要作用。

EMT是上皮細胞由上皮表型向間質表型轉化的生物學過程，EMT在HCC細胞的侵襲和轉移中已被報道起到重要作用[4，14]。另外，有研究發現在腫瘤中PTEN表達是降低或缺失的，因此PTEN被認為是一種抑癌基因[15]。在肝癌中，PTEN被證實是表達異常的，其缺失或低表達促進肝癌的進展[16]。然而，肝癌中PTEN表達異常的具體機制目前尚不清楚。有研究發現miR-21[16]、miR-216[17]、miR-221[18]、miR-29a[19]和miR-32[20-21]可以調控PTEN的表達。本研究通過數據庫（Target-Scan 6.2和MiRanDa）預測miR-616的靶基因，發現PTEN可能是miR-616靶基因。

筆者在HCC組織中對同源性磷酸酶-張力蛋白PTEN、上皮標志物E-cadherin及間質標志物vimentin進行免疫組化染色，發現低表達miR-616的HCC組織中PTEN、E-cadherin的表達高于miR-616高表達組，而vimentin的表達低于miR-616高表達組。相關性分析結果提示miR-616與PTEN、E-cadherin呈負相關，而與vimentin呈正相關，以上結果提示miR-616可能與肝癌中PTEN表達及EMT有關。本研究使用miR-616抑制劑抑制Hep3B細胞中miR-616的表達后，發現PTEN和E-cadherin蛋白的表達是上調的，而vimentin的表達是降低的。此外，筆者發現在miR-616低表達的Hep3B細胞中轉染PTEN siRNA可以抵消miR-616抑制物所帶來的效果，即同時使用miR-616抑制物及PTEN siRNA轉染Hep3B細胞，相比較單獨轉染miR-616抑制物組，實驗組PTEN及E-cadherin蛋白的表達降低，而vimentin蛋白表達升高。

綜上所述，筆者考慮miR-616可能通過靶向調控PTEN表達，從而使肝癌細胞發生EMT，進一步促進肝癌細胞侵襲轉移，miR-616具有成為新的HCC分子標志物及生物治療靶點的潛能，但有待進一步研究證實。

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Expression of miR-616 in human hepatocellular carcinoma and its effect on tumor invasion and metastasis

LIU Xin,XU Qiuran, ZHANG Meiqi,et al.Department of Neurosurgery,Departmentof Emergency,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

浙江省自然科學基金（LY16H160043）；浙江省醫藥衛生科技計劃一般項目（2016KYA022、2015KYB033）

310014 杭州，浙江省人民醫院神經外科（劉欣），急診醫學科（許秋然、張美齊、蔡文偉、涂建鋒）；西安交通大學醫學院附屬第一醫院肝膽外科（劉青光）

microRNA-616在肝細胞癌侵襲轉移中的作用機制研究

1 材料和方法

2 結果

3 討論