蝦青素對紅小丑魚消化酶活性的影響

張 芬，王亞如，朱志煌，林 琪，杜 虹*

(1. 汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東 汕頭 515063；2．福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

蝦青素對紅小丑魚消化酶活性的影響

張 芬1，王亞如2，朱志煌2，林 琪2，杜 虹1*

(1. 汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東 汕頭 515063；2．福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

本實驗以初始體質(zhì)量為(4.88±0.90)g、體長為(4.85±0.32)cm的紅小丑魚(Amphiprionfrenatus)為養(yǎng)殖對象，研究飼料中添加0(對照組)、2‰、4‰、6‰、8‰的蝦青素對紅小丑魚消化酶活性的影響。本試驗每組3個重復(fù)，每個重復(fù)6尾魚，飽食投喂2次/d(投喂時間為08∶30和14∶30)，試驗周期為20 d。結(jié)果表明：添加蝦青素組的紅小丑魚胃腸消化酶活性均高于未添加蝦青素組，當(dāng)蝦青素添加量為4‰時，紅小丑魚前腸蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及后腸淀粉酶活性達(dá)到最高(P<0.05)；當(dāng)添加量為6‰時，其胃脂肪酶和淀粉酶活性最高(P<0.05)；當(dāng)添加量為8‰時，其胃和后腸的蛋白酶以及后腸脂肪酶的活性達(dá)到最高(P<0.05)。因此，在飼料中添加4‰～8‰的蝦青素能夠較有效地提高紅小丑魚消化器官的消化酶活性。

紅小丑魚；蝦青素；蛋白酶活力；脂肪酶活力；淀粉酶活力

消化酶是一類由消化系統(tǒng)分泌的具有營養(yǎng)消化作用的酶類。魚類通過消化酶消化攝入的食物來獲取能量和營養(yǎng)素。消化酶活性的變化還是指示魚類在不同生長階段的營養(yǎng)狀況和生長性能的一個可靠參數(shù)[1-2]。魚類消化酶的活性在不同組織器官也不盡相同，且飼料中的添加劑能顯著影響魚類消化酶活性[3-4]。

蝦青素(Astaxanthin)，又名蝦黃素、蝦黃質(zhì)，主要指來源于藻類、酵母菌、甲殼類動物等的類胡蘿卜素含氧衍生物。蝦青素因具有抗癌、抗氧化、抗強(qiáng)光照射及改善觀賞魚類體表著色效果等功能，而有較高的營養(yǎng)保健價值[5]。目前蝦青素主要應(yīng)用在以下幾個方面[6-7]：1)抗氧化劑：醫(yī)藥及食品保健品；2)抗癌變預(yù)防治療；3)防曬劑；4)眼病的治療和預(yù)防；5)增強(qiáng)免疫功能：幫助老齡動物恢復(fù)免疫力；6)食品和化妝品著色劑；7)飼料添加劑。

紅小丑魚(Amphiprionfrenatus)又名番茄小丑，屬雀鯛科(Pomacentridae)、海葵魚亞科(Amphiprioninae)魚類，其分布于印度洋和太平洋珊瑚礁海域，是重要的海水觀賞魚之一[8-9]。由于野生捕撈小丑魚數(shù)量有限，不易進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，于是近幾年興起了人工繁育海水觀賞魚產(chǎn)業(yè)，但是人工養(yǎng)殖的小丑魚體色比野生品種暗淡。蝦青素拌料投喂是一種調(diào)控紅色系觀賞魚體色的常用方法，可以有效解決小丑魚體色暗淡問題[10-11]。關(guān)于蝦青素對魚蝦的作用研究主要集中在對其體色及免疫功能影響等方面[12-14]，而蝦青素對紅小丑魚消化酶活性影響的研究尚未報道。因此，本試驗以添加不同含量蝦青素的飼料投喂紅小丑魚，研究其對紅小丑魚胃腸消化酶活性的影響，進(jìn)而分析蝦青素對紅小丑魚生長作用的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼養(yǎng)管理

紅小丑魚幼苗(孵化后60 d)由福建省水產(chǎn)研究所提供，飼養(yǎng)試驗在福建省水產(chǎn)研究所觀賞魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。隨機(jī)選取規(guī)格統(tǒng)一、體質(zhì)健壯、食欲良好的魚苗分別放入5個水族箱(50 cm×45 cm×38 cm)，將每個水箱用白色塑料擋板隔成3部分(3個重復(fù))，每個隔間放6尾魚，試驗魚的平均體質(zhì)量為(4.88±0.90)g，平均體長為(4.85±0.32)cm。本試驗以投喂基礎(chǔ)飼料的0%蝦青素為對照組，實驗組飼料蝦青素的添加量分別為2‰、4‰、6‰和8‰。養(yǎng)殖期間，每天飽食投喂2次(投喂時間為08∶30和14∶30)，飼養(yǎng)周期為20 d。飼養(yǎng)水箱具有封閉式循環(huán)過濾系統(tǒng)，每周換水1/2，飼養(yǎng)期間水溫(26±1)℃，pH8.0～8.1，鹽度30～32，氨氮含量低于0.1 mg/L，溶解氧高于5.8 mg/L。

1.2 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料配方組成和主要營養(yǎng)指標(biāo)見表1。在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的蝦青素，蝦青素(德國巴斯夫)由北京中農(nóng)牧揚生物技術(shù)有限公司提供。

注：1.混合維生素(mg/kg預(yù)混料)：維生素A 2500 IU，維生素D 2400 IU，維生素C 150，維生素E 30，維生素K 10，維生素B110，維生素B220，維生素B540，維生素B610，維生素B71；維生素B115，維生素B120.02，肌醇 400。2.混合礦物質(zhì)(mg/kg預(yù)混料)：Zn 100，F(xiàn)e 150，Cu 3，Mn 20，I 0.8，Co 0.12， Se 0.1，Mg 100。
Notes：To contain vitamin and mineral in diet added as premix(mg/kg diet):VA，2500 IU；VD，2400 IU；VC，150；VE，30；VK，10；VB1，10；VB2，20；VB5，40；VB6，10；VB7，1；VB11，5；VB12，0.02；Inositol，400；Zn，100；Fe，150；Cu，3；Mn，20；I，0.8；Co，0.12；Se，0.1；Mg，100.

1.3 樣品的制備和消化酶活性測定

1.3.1 酶活測定

首先在冰盤中對所有實驗活魚進(jìn)行解剖，取出胃、前腸和后腸(剝除多余的脂肪和結(jié)締組織)，稱重，并按照實驗分組分裝于EP管中，加入其重量9倍(m/m)的PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)后，用勻漿器將樣品組織充分勻漿，然后離心20 min(3 500 r/min)，收集上清液。

在酶標(biāo)包被孔板上設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL(樣品最終5倍稀釋)，輕輕晃動混勻；除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，用封板膜封板后置37℃溫育60 min，小心揭掉封板膜，棄去液體，然后甩干；將濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后加滿每個酶標(biāo)孔，靜置30 s后棄去洗滌液，如此重復(fù)5次，晾干；再往每孔中加入50 μL顯色劑A，之后繼續(xù)加入50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；最后向每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)為黃色)；以空白孔調(diào)0，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。酶標(biāo)包被孔板由上海酶聯(lián)生物試劑公司提供。

1.3.2 酶活計算

用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。酶活力(IU/L)=(A×K-B)×N，其中A為吸光度；K為回歸方程斜率；B為截距；N為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

將所有試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010及SPSS 17.0進(jìn)行分析處理用(mean±SD)表示。利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)合Duncan’s法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料中蝦青素對紅小丑魚蛋白酶活性的影響

如圖1所示，投喂蝦青素實驗組紅小丑魚的胃和腸道蛋白酶活性相比對照組都有所提高。當(dāng)蝦青素添加量為8‰時，胃蛋白酶活性達(dá)到最高(P<0.05)；紅小丑魚前腸蛋白酶的活性隨飼料中蝦青素含量的增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)蝦青素添加量為4‰時，前腸蛋白酶活性達(dá)到最高(P<0.05)；后腸蛋白酶活性隨飼料中蝦青素含量的增加先升高后降低，當(dāng)添加量為8‰時，后腸蛋白酶活性最高(P<0.05)。

2.2 飼料中蝦青素對紅小丑魚脂肪酶活性的影響

如圖2所示，紅小丑魚胃和前腸脂肪酶活性隨飼料中蝦青素含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；后腸脂肪酶活性隨飼料中蝦青素含量的增加而升高。當(dāng)添加量為6‰時，胃脂肪酶活性最高(P<0.05)；當(dāng)添加量為4‰時，前腸脂肪酶活性最高(P<0.05)；當(dāng)添加量為8‰時，后腸脂肪酶活性最高(P<0.05)。

2.3 飼料中蝦青素對紅小丑魚淀粉酶活性的影響

如圖3所示，隨飼料中蝦青素含量的增加，紅小丑魚胃、前腸和后腸淀粉酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)添加量為6‰時，胃淀粉酶活性最高(P<0.05)；當(dāng)添加量為4‰時，前腸和中腸淀粉酶活性最高(P<0.05)。

3 討論

蝦青素不僅具有良好的抗氧化、抗衰老以及抗癌作用，還能夠促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長繁殖，因此被廣泛應(yīng)用于藥品、保健品、化妝品和水產(chǎn)動物飼料等領(lǐng)域[12-14]。

蝦青素的抗氧化性能主要體現(xiàn)在其能清除生物體內(nèi)的有害自由基。生物體在代謝過程中會產(chǎn)生活性氧自由基，其未成對的電子化學(xué)性質(zhì)活潑，可破壞生物膜上的多元不飽和脂肪酸，導(dǎo)致生物膜通透性改變；自由基還能夠與蛋白質(zhì)連接，致使蛋白質(zhì)變性或結(jié)構(gòu)破壞；另外自由基還可以攻擊核酸分子，造成基因突變等一系列的破壞，導(dǎo)致生物體產(chǎn)生病變[15-16]。而蝦青素分子結(jié)構(gòu)中的不飽和共軛雙鍵及其兩端紫羅酮環(huán)上的不飽和酮基可以吸引代謝過程中產(chǎn)生的未配對的自由基電子，消除生物體產(chǎn)生的有害活性代謝產(chǎn)物，從而避免由自由基氧化引發(fā)的癌癥、白內(nèi)障等多種疾病，并能防止機(jī)體老化[17]。蝦青素的抗氧化、抗衰老、防癌癥的功能作用早在小鼠、魚蝦體內(nèi)被證實[18-19]。

此外，有研究指出在飼料中添加蝦青素可以提高凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、血鸚鵡(CichlasomacitrinellumXC.synspilum)、七彩神仙魚(Symphysodonharaldi)等水產(chǎn)動物的增重率和生長率[20-22]。Gouveia等[23]使用含有天然蝦青素的綠球藻(Chlorococcumsp.)和螺旋藻(Spirulinaplatensis)等喂食錦鯉(Cyprinuscarpio)和金魚(Carassiusauratus)，發(fā)現(xiàn)對其生長和體形沒有顯著性的影響，而Amar等[24]以虹鱒(Oncorhynchusmykiss)為實驗材料也得出相同的結(jié)果。但目前蝦青素具體影響動物生長的機(jī)制還不清楚，出現(xiàn)這樣不同的結(jié)論可能是由于水產(chǎn)動物消化道對蝦青素的消化吸收、沉積能力以及代謝方式不同所引起的。

消化酶活性是反映魚類消化機(jī)能的重要指標(biāo)，添加蝦青素飼養(yǎng)水產(chǎn)動物可能影響其消化酶活性[25]。消化酶活性決定著魚類對營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的能力，其與魚類的生長、發(fā)育和繁殖等重要生命活動直接相關(guān)[25]。影響消化道內(nèi)消化酶活性的因素較多，主要有pH、溫度、鹽度、重金屬離子、動物食性及生長階段、飼料組成、外源消化酶、微生態(tài)制劑等[26-28]。近年來，有多種飼料添加劑(如氨基酸、酸化劑、維生素、糖萜素、中草藥等)被用來促進(jìn)魚類生長、提高飼料利用率及增強(qiáng)魚體抗病能力。這些添加劑的加入往往能夠改變魚類消化酶活力。目前蝦青素對生物體內(nèi)消化酶活性影響的研究未見報道。本實驗通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的蝦青素，研究其對紅小丑魚體內(nèi)的胃腸部消化酶活性的影響。實驗結(jié)果表明，紅小丑魚胃腸部消化酶活性受蝦青素的影響較為明顯，其脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的活性在一定的閾值內(nèi)隨著蝦青素含量的增加而升高，且實驗組的消化酶活性均高于對照組。因此，在飼料中添加蝦青素能夠提高紅小丑魚消化器官的消化酶活性。

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Astaxanthin on the influence of digestive enzyme activity ofAmphiprionfrenatus

ZHANGFen1，WANGYaru2，ZHUZhihuang2，LINQi2，DUHong1*

(1.Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，China；2.Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

Clown fish(Amphiprionfrenatus) was one of the most popular marine ornamental fish，and its market share was increasing in aquaculture industry.Astaxanthin could improve the growth rate and immune response of fish，and digestive enzyme could affect the growth performance of fish.This study analyzed the effect of dietary astaxanthin on the digestive enzyme activity of clown fish.90 juveniles of 30 days-post-hatch with the average weight and length of(4.88±0.32) g and(4.85±0.32) cm were divided into 5 groups，which was possessed of the same 3 replicates，and were fed with basal diet containing 0，2‰，4‰，6‰ and 8‰ astaxanthin for 20 days，respectively.The results indicated that dietary astaxanthin increased the digestive enzyme activities of clown fish.When dietary astaxanthin content was 4‰，the activities of anterior intestine protease，lipase，amylase and posterior intestine amylase were highest(P<0.05).When dietary astaxanthin content was 6‰，the activities of stomach lipase and amylase were highest(P<0.05).When dietary astaxanthin content was 8‰，the activities of posterior intestine protease，amylase and pepsase were highest(P<0.05).In conclusion，the digestive enzyme activities ofA.frenatuscould be effectively improved through feeding basal diet with 4‰～8‰ astaxanthin.

Amphiprionfrenatus；astaxanthin；protease；lipase；amylase

2017-04-26

小丑魚早期性腺發(fā)育分化的研究(2016R1101005-1).

張 芬(1990-)，女，在讀研究生，研究方向：觀賞魚體色研究. E-mail：fzhang15@163.com

杜 虹(1976-)，女，教授，研究方向：海洋生態(tài)學(xué)研究.E-mail：hdu@stu.edu.cn

張 芬，王亞如，朱志煌，等.蝦青素對紅小丑魚消化酶活性的影響[J].漁業(yè)研究，2017，39(3)：188-194.

S917.4

A

1006-5601(2017)03-0188-07