DC-CIK對卵巢癌細胞殺傷作用及臨床治療安全性評價*

文 萍，周 艷，溫詳臣，李亞奇，李小安1,△

1.成都醫學院(成都 610500)；2. 成都醫學院第一附屬醫院 消化內科(成都 610500)；3.成都醫學院第一附屬醫院 消化系腫瘤與微環境四川省高校重點實驗室(成都 610500)

·論著·

DC-CIK對卵巢癌細胞殺傷作用及臨床治療安全性評價*

文 萍1,3，周 艷2,3，溫詳臣2，李亞奇1,3，李小安1,2,3△

1.成都醫學院(成都 610500)；2. 成都醫學院第一附屬醫院 消化內科(成都 610500)；3.成都醫學院第一附屬醫院 消化系腫瘤與微環境四川省高校重點實驗室(成都 610500)

目的 樹突狀細胞(dendritic cells，DC)和細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK)經體外共培養后，探討其增殖能力和對卵巢癌細胞的殺傷能力，并對其治療卵巢腫瘤的安全性進行評價。方法 提取健康志愿者外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，通過不同細胞因子組合，分別誘導培養DC和CIK細胞，并共培養，用苔盼藍染色計算活細胞擴增倍數，流式細胞術檢測細胞表型，乳酸脫氫酶法(LDH)檢測細胞毒性，酶聯免疫劑吸附法(ELISA)檢測細胞分泌因子水平。在卵巢癌患者簽署知情同意書后，提取卵巢癌患者PBMC，誘導DC、CIK，并共培養，將質檢合格的DC、CIK細胞通過腹腔注射的方式回輸入患者體內，根據美國國立癌癥研究所發布的《常見不良反應標準》，對不良反應進行判定，評價DC-CIK細胞治療的近期安全性。結果 DC和CIK細胞共培養后，CIK增殖速度明顯快于CIK單獨培養，DC和CIK成熟分型明顯增加，對腫瘤的殺傷能力比CIK單獨培養時更強，且隨著效靶細胞比的增加，殺傷腫瘤能力逐漸增強；DC-CIK回輸早期，患者并未出現明顯副反應。結論 DC-CIK共培養后，細胞增殖能力、成熟分型及協同抗瘤作用均增強；此外，DC-CIK相對安全可行。

樹突狀細胞;細胞因子激活的殺傷細胞;卵巢癌

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是迄今為止發現的體內功能最強大的抗原呈遞細胞，能高效地攝取、加工及呈遞抗原，還能激活初始T淋巴細胞，調動人體自身免疫反應，從而達到長久、持續地監視并殺死人體腫瘤細胞[1]。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK)可由細胞因子組合刺激外周血淋巴細胞誘導而來，能夠通過直接或間接的方式，精準殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞、組織和器官沒有明顯影響[2]。在本研究中，通過多因子共同作用，誘導正常人外周血單核細胞分化為DC、CIK,并將兩者共培養，觀察細胞增殖能力、殺傷能力、細胞表型變化及分泌細胞因子水平等；同時，通過對1名卵巢癌患者進行DC-CIK免疫治療，監測副反應，評價臨床安全性，探索DC-CIK治療卵巢癌的有效性、安全性和可行性。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

細胞培養箱、離心機購自Thermo公司；流式細胞儀購自BD公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋公司；細胞因子腫瘤相關壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、干擾素-γ(interferon-r，IFN-γ)，重組人白介素-2(recombinant human IL-2)和重組人白介素-4(recombinant human IL-4)購自Peprotech公司；CD3-OKT3購自Thermo公司；流式抗體CD3、CD4、CD8、CD56、C83、CD86、CD40購自eBioscience公司；IFN-γ、IL-2 ELISA試劑盒購自上海酶聯公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 DC、CIK細胞的培養 抽取健康志愿者外周靜脈血，制備外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，培養2 h后，吸取懸浮細胞，培養基加入1 000 U/mL的IFN-γ培養24 h，再加入50 ng/mL的CD3-OKT3、300 U/mL的IL-2，每48 h進行半換液1次；貼壁細胞培養基加入1 000 U/mL的GM-CSF、500 U/mL的IL-4，第2天和第4天進行半換液，第5天加入500 U/mL的TNF-α；第7天，將DC和CIK按照1∶10接種于培養皿中，并添加300 U/mL的IL-2，每48 h進行半換液1次，并補足細胞因子。

1.2.2 細胞表型檢測 流式細胞術分別檢測單獨培養7 d及共培養7 d的DC、CIK的細胞表型。分別收集106個DC細胞和106個CIK細胞，預冷的PBS洗兩遍后，分別用100 μLPBS重懸細胞。CIK細胞分別添加5 μL CD3、CD8、CD4、CD56以鑒定其免疫分型；DC細胞分別添加5 μL CD86、CD83、CD40以鑒定其免疫分型。

1.2.3 細胞活性檢測 利用苔盼藍染色，檢測活細胞數，根據活細胞數繪制細胞增殖曲線。收集DC和CIK細胞，PBS洗兩遍后，用PBS重懸細胞，分別取90 μL細胞懸液和10 μL 0.4% 苔盼藍充分混勻后，取10 μL混合懸液至計數板和蓋玻片空隙中，計數。

1.2.4 細胞殺傷試驗 以實驗組為效應細胞，以單獨培養7 d的CIK細胞為對照組效應細胞，以人卵巢癌細胞Hey、A2780為靶細胞，分別將實驗組效應細胞和對照組效應細胞與靶細胞按效靶為2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例加入96孔板中，每孔含靶細胞104個，終體積為200 μL，設置3個副孔，培養4 h后，取上清，離心后，按LDH試劑盒說明進行檢測。

1.2.5 細胞因子水平測定 將共培養7 d的DC-CIK、單獨培養7 d的CIK分別與人卵巢癌細胞Hey、A2780共培養24 h，收集上清，以3 000 r/min，離心半徑為12 cm，離心15 min，取上清，離心后，按ELISA試劑盒說明書進行IFN-γ和IL-2的檢測。

1.2.6 DC-CIK對卵巢癌病人的治療 抽取卵巢癌病人外周靜脈血，按1.2.1所述誘導為DC、CIK，共培養7 d后，利用苔盼藍染色進行細胞活性檢測。同時，取一定培養上清，送至成都醫學院第一附屬醫院檢驗科進行支原體、內毒素、細菌和真菌檢測?；剌斍? d，最大限度抽取病人腹腔液體。將質檢合格的109個CIK細胞和106個DC細胞用100 mL注射用生理鹽水重懸，30 min內通過腹腔注射的方式回輸入腹腔。連續3 d回輸。

1.2.7 DC-CIK治療的安全性評價 DC-CIK細胞回輸1個月內對患者進行隨訪，觀察患者治療前后血常規、肝腎功的變化，監測有無發熱、過敏等不良反應。不良反應根據美國國立癌癥研究所發布的《常見不良反應標準》進行判定。將不良反應分為5級：1 級無癥狀或癥狀極輕微，無需治療；2 級表現為與年齡相當的工具性日常生活活動受限，如做飯、購物、使用電話、理財等；3 級表現為導致住院時間延長、致殘、個人日常生活活動受限，但不會立即危及生命；4級危及生命，需要緊急治療；5 級會發生死亡。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 CIK細胞成功誘導并大量增殖

培養第7天，可見CIK細胞體積增大，部分細胞呈集落樣懸浮生長，且隨著培養時間延長而成團細胞增多。與DC細胞共培養后，CIK細胞明顯進入倍數增殖期，同時不規則細胞數量明顯增多。共培養7 d后，CIK細胞總數增殖到初始的(13.68±1.27)倍(圖1～2)。

圖1 CIK細胞培養

圖2 CIK細胞增殖趨勢

2.2 細胞免疫分型

2.2.1 DC細胞表型檢測 流式細胞術鑒定DC細胞表型，DC-CIK共培養中，DC細胞表面CD40的表達率為65.40%，CD83的表達率為86.10%，CD86的表達率為86.70%，而DC單獨培養時，細胞表面分子表達率分別為40.00%、52.40%、57.00%。結果表明，DC細胞成熟，且DC和CIK共培養時，成熟DC細胞所占比例更大(圖3A)。

2.2.2 CIK細胞表型檢測 流式細胞術鑒定CIK細胞表型，DC和CIK共培養中，CIK細胞表面CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3+CD4+的表達率分別為82.10%、65.10%、50.20%，而CIK單獨培養的相應表達率分別68.90%、45.80%、34.90%。結果表明，DC可以促進CIK向細胞毒性T細胞及自然殺傷T細胞分化(圖3B)。

圖3 DC和CIK細胞的免疫分型

2.3 細胞殺傷試驗

與CIK組相比，在2.5∶1～20∶1的效靶范圍內，隨著效靶比的增加，效應細胞對人卵巢癌細胞Hey、A2780的殺傷能力逐漸增強，且DC-CIK共培養對腫瘤細胞的殺傷作用更強(P< 0.001)(圖4)。

圖4 DC-CIK、CIK對A2780和Hey細胞的殺傷作用

注：A.CIK細胞和DC-CIK細胞對A2780的殺傷作用；圖B.CIK細胞和DC-CIK細胞對Hey的殺傷作用；與CIK組比較，*P< 0.05,**P< 0.001

2.4 細胞因子水平測定

共培養24 h后，分別收集上清檢測IL-2和IFN-γ，與兩株人卵巢癌細胞共培養，DC-CIK組分泌的IL-2和IFN-γ均明顯高于CIK組(圖5)。

圖5 DC-CIK、CIK與卵巢癌細胞共培養的細胞因子分泌水平

注：A.IL-2分泌水平；B.IFN-γ分泌水平；與CIK組比較，*P< 0.05,**P< 0.001

2.5 細胞質檢

DC-CIK細胞回輸前，細胞質檢通過內毒素、細菌、真菌、支原體的檢測來評估，結果如下所示(表1)。

表1 DC-CIK細胞質檢

2.6 近期安全性評定

治療1月后，患者血常規、肝腎功無明顯變化，治療后第3天出現輕微畏寒和發熱，對癥處理后恢復正常，未達3～6級不良反應。

3 討論

1973年，Steinman等[3]在小鼠脾臟中首次發現DC。成熟DC表面具有大量抗原呈遞分子、細胞間黏附分子、共刺激分子等，具有強大的激活細胞毒性T細胞和輔助性T細胞的能力[4-5]，能夠啟動和調節T細胞介導的免疫反應過程，在免疫應答中處于舉足重輕的地位。近年來，以DC為基礎的免疫治療廣泛應用于黑色素瘤[6]、腎癌[7]、膀胱癌[8]、子宮內膜癌[9]、肺癌[10]等。研究[11]顯示，在晚期腫瘤患者體內，腫瘤細胞釋放的多種因子可影響DC的增殖和成熟，導致DC的數量缺乏和功能低下，無法有效的啟動和調節免疫反應，故體外誘導大量成熟、功能性DC，并回輸入腫瘤患者體內，對腫瘤的免疫治療具有重要意義。本研究中，通過GM-CSF、IL-4，TNF-α的共同作用誘導DC，免疫表型檢測結果顯示：DC表面高表達CD40、CD83、CD86，表明已成功在體外誘導成熟的DC細胞。

PBMC在多種細胞因子的組合作用下可誘導為CIK，具有強大的增殖能力和細胞毒性，具有廣譜抗瘤、對化療耐藥細胞株有效等特點[12]。Poh等[13]報道，CIK可以抑制血液瘤的爆發；Huang等[14]報道，CIK聯合TACE和RFA治療85例肝癌，總應答率達到76.5%。CIK中發揮作用的主要為CD3+CD56+型T細胞，因此，兼具T細胞的抗瘤活性和自然殺傷細胞的非MHC限制性抗瘤特性[15]，但其在正常人外周血中數量僅為1%～5%[16]，而細胞免疫治療的關鍵是能否獲得足夠數量并且具有高效殺傷活性的免疫效應細胞。本研究通過CD3、IL-2、IFN-γ等細胞因子組合誘導CIK細胞，免疫表型檢測結果表明：體外成功誘導具有細胞毒性T細胞及自然殺傷T細胞的CIK細胞。

作為腫瘤免疫治療的兩個重要部分，DC能夠精準識別抗原、高效激活免疫系統，CIK自身具有細胞毒性并能分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，二者聯合培養，有助于改善體內T細胞的受抑情況，從而發揮協同抗瘤作用。Cui等[17]報道，利用DC、CIK聯合治療121例腫瘤患者48 h后，免疫應答率高達76.9%，且未出現明顯副反應。Wang等[18]報道，負載腫瘤抗原的DC和CIK共培養，可以提高CIK細胞的增殖、分化和細胞毒活性，對視網膜母細胞瘤Y79細胞具有一定殺傷能力，甚至對化療藥物耐受的腫瘤細胞也表現出明顯的殺傷作用。本研究中，CIK增殖趨勢圖顯示：當CIK與DC共培養7 d，CIK成倍數增殖，細胞總數為擴增初期的(13.68±1.27)倍。此外，細胞免疫分型結果顯示：當DC-CIK共培養時，DC可以促進CIK向細胞毒性T細胞及自然殺傷T細胞分化，CIK有助于促進DC細胞成熟。說明通過共培養，可以獲得大量高效的免疫細胞，對于推動臨床腫瘤免疫治療具有重要意義。

Zhan等[19]報道，DC-CIK共培養后，對腎癌細胞的殺傷能力增強。本研究殺傷試驗顯示，DC-CIK組對卵巢癌細胞Hey、A2780殺傷能力明顯強于CIK組，并且隨著效靶比增加，兩組細胞對卵巢腫瘤細胞的殺傷能力均逐漸增強，但DC-CIK組仍優于CIK組。CIK可通過誘導腫瘤細胞凋亡、分泌細胞因子等途徑發揮殺瘤作用，還可通過調節免疫系統，從而間接發揮殺瘤作用。共培養上清分泌細胞因子檢測結果顯示:腫瘤細胞與DC-CIK組共培養的上清中，細胞因子IL-2、IFN-γ的表達量更高，從另一方面也驗證了DC-CIK組的殺瘤能力優于CIK組。此外，接受DC-CIK治療的患者，初期雖出現輕微的畏寒、發熱等不適癥狀，但并未達到3～6級不良反應，且1月內未見其他副反應，說明DC-CIK細胞治療具有相對安全性。

綜上所述，本研究初步證實DC-CIK細胞增殖、殺瘤作用均高于單純CIK細胞，同時，在臨床卵巢癌的近期治療中相對安全，為臨床治療卵巢癌提供了一定的實驗和臨床依據。

[1]deVleeschouwer S, Rapp M, Sorg R V,etal. Dendritic Cell Vaccination In Patients With Malignant Gliomas: Current Status And Future Directions[J]. Neurosurgery, 2006, 59(5): 988-1000.

[2]Mesiano G, Todorovic M, Gammaitoni L,etal. Cytokine-induced killer (CIK) cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumors[J]. Expert Opin Biol Ther, 2012, 12(6): 673-684.

[3]Steinman R M, Cohn Z A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution[J].J Exp Med, 1973，137(5):1142-1162.

[4]周昌菊, 馬薇, 周建大, 等. 自體宮頸癌-樹突細胞疫苗激活的CTL殺傷效應[J]. 癌癥, 2006, 25(2): 143-147.

[5]Zhai Y, Zhang Z Y, Wang S Z,etal. Tumor cells lysates pulsed dendritic cells for immunotherapy of ovarian cancer in rats: in-vitro study[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2009, 89(9): 635-640.

[6]Roberts E W, Broz M L,Binnewies M,etal. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma [J]. Cancer Cell, 2016, 30(2): 324-336.

[8]Ayari C, LaRue H, Hovington H,etal. High level of mature tumor-infiltrating dendritic cells predicts progression to muscle invasion in bladder cancer[J]. Hum Pathol, 2013, 44(8): 1630-1637.

[9]Coosemans A, Vanderstraeten A, Tuyaerts S,etal. Wilms′ Tumor Gene 1 (WT1)-loaded dendritic cell immunotherapy in patients with uterine tumors: a phase I/II clinical trial [J]. Anticancer Res, 2013, 33(12): 5495-5500.

[10] Zhong R, Han B, Zhong H，etal. A prospective study of the efficacy of a combination of autologous dendritic cells, cytokine-induced killer cells, and chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer patients[J]. Tumour Biol, 2014, 35(2):987-994.

[11] TavaresMurta B M, Cunha Fde Q, Miranda R,etal. Differential tumor microenvironment in human ovarian cystic tumors[J]. Tumori, 2004, 90(5): 491-497.

[12] Shi L, Zhou Q, Wu J,etal. Efficacy of adjuvant immunotherapy with cytokine-induced killer cells in patients with locally advanced gastric cancer[J]. Cancer Immunol Immunother, 2012, 61(12): 2251-2259.

[13] Poh S L, Linn Y C. Immune checkpoint inhibitors enhance cytotoxicity of cytokine-induced killer cells against human myeloid leukaemic blasts[J]. Cancer Immunol Immunother, 2016, 65(5): 525-536.

[14] Huang Z M, Li W, Li S,etal. Cytokine-induced killer cells in combination with transcatheter arterial chemoembolization and radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma patients[J]. J Immunother, 2013, 36(5): 287-293.

[15] Lanier L L, Le A M, Civin C I,The relationship of CD16 (Leu-11) and Leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes[J].J Immunol, 1986,136(12):4480-4486.

[16] Nelson B H. The impact of T-cell immunity on ovarian cancer outcomes[J].Immunol Rev, 2008, 222: 101-116.

[17] Cui Y, Yang X, Zhu W,etal. Immune response, clinical outcome and safety of dendritic cell vaccine in combination with cytokine-induced killer cell therapy in cancer patients[J]. Oncol Lett, 2013, 6(2): 537-541.

[18] Wang Y F,Kunda P E, Lin J W,etal. Cytokine-induced killer cells co-cultured with complete tumor antigen-loaded dendritic cells, have enhanced selective cytotoxicity on carboplatin-resistant retinoblastoma cells[J]. Oncol Rep, 2013, 29(5): 1841-1850.

[19] Zhan H L, Gao X, Pu X Y，A randomized controlled trial of postoperative tumor lysate-pulsed dendritic cells and cytokine-induced killer cells immunotherapy in patients with localized and locally advanced renal cell carcinoma[J]. Chin Med J (Engl), 2012，125(21):3771-3777.

The Killing Effect of DC-CIK on Ovarian Cancer Cells and the Safety Evaluation of Its Clinical Treatment

Wen Ping1,3, Zhou Yan2,3, Wen Xiangchen2, Li Yaqi1,3, Li Xiaoan1,2,3△.

1. Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China; 2. Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China; 3. The Gastroenterology Tumor and Microenvironment Laboratory, The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To explore the proliferation and the killing effect of cytokine-induced killer cells (CIK) co-cultured with dendrite cells (DC) on the ovarian cancer cells and evaluate the clinical safety. Methods The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from healthy volunteers were induced to obtain DC and CIK respectively and co-cultured through the combination of different cytokines. Trypan blue staining was used to observe the proliferation of cells, the flow cytometer was used to measure the cell phenotypes, the lactate dehydrogenase (LDH) assay was adopted to measure the killing effect, and ELISA was used to detect the levels of cell secretory factors. With the permission of patients with ovarian cancer, PBMC was isolated and induced to DC and CIK. The qualified DC-CIK cells were infused back to the patients by intraperitoneal injection. The side effects were evaluated on the basis of Common Terminology Criteria for Adverse Events Version (CTCAE) published by National Cancer Institute (NCI). Results The proliferation rate of CIK co-cultured with DC was higher than that of the CIK cultured alone. The mature phenotypes of CIK and DC in the co-cultured group were increased significantly and their killing effect on ovarian cancer cells was greater than that of the CIK cultured alone. As the proportion of effector cells to target cells increases, the killing effect also increased. The obvious side effect didn′t appear in the early phase of DC-CIK reinfusion. Conclusion The rate of proliferation, the number of mature cells, and the effect of killing tumors are increased significantly after DC and CIK are co-cultured in vitro. Besides, the treatment of DC-CIK for ovarian cancer is relatively safe and feasible.

Dendrite cells; Cytokine-induced killer cells; Ovarian cancer

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20170322.1028.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.03.011

四川省教育廳重點項目(No：16ZA0280)；四川省教育廳創新團隊(No: 16TD0028)

R737.31

A

△通信作者：李小安，E-mail：435445611@qq.com