3種殺菌劑及其復配劑對斑馬魚的急性毒性

瞿唯鋼，楊淞霖，王會利，郭寶元,*

1. 中國農業部農藥檢定所，北京 1001252. 中國科學院生態環境研究中心，北京 100085

3種殺菌劑及其復配劑對斑馬魚的急性毒性

瞿唯鋼1，楊淞霖2，王會利2，郭寶元2,*

1. 中國農業部農藥檢定所，北京 1001252. 中國科學院生態環境研究中心，北京 100085

采用“半靜態法”測定了3種農藥及其復配劑對斑馬魚的24 h、48 h、72 h和96 h急性毒性，根據我國《化學農藥環境安全評價實驗準則》中毒性等級劃分標準來劃分它們對斑馬魚的毒性等級，發現35%精甲霜靈懸浮種衣劑的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50均超過10 a.i.mg·L-1，屬“低毒”級，而25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分別為0.704 mg·L-1、0.514 mg·L-1、0.424 mg·L-1、0.262 mg·L-1，根據0.100 a.i.mg·L-1

農藥；斑馬魚；急性毒性；半靜態法

近年來，為了保證作物的正常生長和產量，農藥的使用量越來越大，尤其是發展中國家，如印度。初步估計15%左右的作物產量損失由病蟲害引起，這也是農藥使用越來越廣泛的原因之一。但與此同時，殘留在作物或者土壤中的農藥由于雨水和地表徑流進入附近的水體中，對水體中的生物產生影響。盡管水體中的生物大部分并不是農藥的靶標生物，短時間內并沒有產生致死等現象，但隨著水體中農藥的累積，可能會造成生物繁殖能力下降、生長速率改變、抵御自然變化(pH、溫度和溶解氧)的能力下降等[1]，進而威脅整個生態環境。

農藥的環境污染及風險已經引起了我國政府乃至國際的重視，尤其是對水生生物的污染及風險。目前我國頒布的《化學農藥環境安全評價試驗準則》中第12部分“魚類急性毒性試驗”專門針對農藥對于水體中魚類的毒性風險做出了實驗示范，而美國對于農藥生態風險評價歷史較長，評價模式較為完善，因而我們也參照了美國的“生態風險評價基準”[2]，其中生態受體主要選擇魚類和無脊椎動物中的浮游動物，而斑馬魚是最常用的受體，故我們選擇斑馬魚作為本研究的受試動物。

精甲霜靈((R)-N-(2,6-二甲苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-D-丙胺酸甲酯，metalaxyl-M)，屬于苯基酰胺類殺菌劑，對卵菌菌絲生長、休止孢萌發均具有很強的抑制作用，有良好的內吸傳導性能，對晚疫病有優異的預防、治療和鏟除作用[3]，可用于種子、土壤處理及莖葉處理，主要用于防治瓜果、蔬菜的霜霉病、疫病及馬鈴薯晚疫病等[4]。

咯菌腈(4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧-4-基)吡咯-3-腈，fludioxonil)屬于吡咯類殺菌劑，殺菌作用機理獨特，對灰霉病菌具有很高的抑菌活性[5]，常用來防治番茄、黃瓜、韭菜、草莓和萵苣等多種蔬菜的灰霉病[6]。

嘧菌酯((E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，azoxystrobin)是甲氧基丙烯酸酯類殺菌農藥，高效、廣譜，對幾乎所有的真菌界(子囊菌亞門、擔子菌亞門、鞭毛菌亞門和半知菌亞門)病害如白粉病[7]、銹病、穎枯病、網斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性。可用于莖葉噴霧、種子處理，也可進行土壤處理，主要用于谷物、水稻、花生、葡萄、馬鈴薯、果樹、蔬菜、咖啡、草坪等。

而嘧菌酯、咯菌腈和精甲霜靈復配使用常用于種子處理，可防治大部分種子帶菌及土壤傳染的真菌病害[8-9]。以上3種農藥均在農業生產中廣泛使用，這些農藥在使用后極易隨地表徑流進入水體中，因而衡量它們對水體中生物的影響顯得尤為重要。但目前還未有報道研究它們對斑馬魚的潛在危害，本文為了給水生生物安全評價提供新的毒理學數據，也為了更好地保護生物多樣性，對此展開了專門的毒理學研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 斑馬魚

試驗用斑馬魚(Brachydanio rerio)購自北京中蔬大森林花卉交易市場，批次為AS08P150806。試驗之前在與試驗環境相同條件下飼養12 d。然后在溫度為21～25 ℃，光暗比為16 h:8 h的條件下馴養7 d，試驗前24 h停止飼喂。

1.2 藥劑

35%精甲霜靈懸浮種衣劑(由農業部提供)；25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑(由農業部提供)；80%嘧菌酯水分散粒劑(由農業部提供)；11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑(由農業部提供)。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗用魚馴養

試驗前，挑選足夠數量斑馬魚，在試驗條件下馴養7 d，每天飼喂2次剛孵化的豐年蟲幼體，試驗前24 h停止飼喂。馴養一周死亡率為0%，死亡率未超過5%，試驗前抽檢數量為10%的斑馬魚(10尾)，測量體長、體重，體長在1.7～2.3 cm范圍內，承載量<1.0 g魚·L-1，符合試驗要求。

1.3.2 毒性測試

試驗依據我國《化學農藥環境安全評價試驗準則》[10]第12部分“魚類急性毒性試驗”，農藥環境評價良好實驗室規范[11]，水質-物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法[12]，化學品-魚類急性毒性試驗[13]，ISO[14]以及OECD[15]關于斑馬魚急性毒性測試方法來進行。

采用半靜態法對斑馬魚進行染毒。35%精甲霜靈懸浮種衣劑設定的5個處理組濃度，分別為20、40、60、80、100 a.i.mg·L-1；25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑設定的5個處理組濃度分別為0.180、0.234、0.304、0.395、0.514 a.i.mg·L-1；80%嘧菌酯水分散粒劑設定的5個處理組濃度分別為1.30、1.95、2.93、4.40、6.60 a.i.mg·L-1；11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑設定的5個處理組濃度分別為1.00、1.20、1.45、1.75、2.10 a.i.mg·L-1；，以曝氣自來水為空白對照，對照組和處理組均不設重復，每組加入10尾斑馬魚。

試驗周期為96 h，每隔24 h更換原有藥液，每隔24 h測定溶液的pH值、溫度、溶解氧含量(DO)。

分別在0 h與24 h更換試驗溶液之前從各處理組取100 mL的供試物溶液，于冰箱中凍存，用于供試物含量的測定。

觀察距試驗開始24 h、48 h、72 h、96 h時間間隔后各組斑馬魚中毒與死亡情況。

1.3.3 數據處理

以藥劑濃度的對數值為自變量(x)，以相應濃度下斑馬魚死亡率的幾率值為因變量(Y)，采用SPSS數據處理軟件及Probit程序進行回歸分析，建立“劑量-效應”線性方程，計算出LC50(或LD50)值及其95%置信限。

1.3.4 毒性等級劃分標準

根據我國《化學農藥環境安全評價實驗準則》[10]中對魚類的毒性等級劃分標準來劃分4種農藥對斑馬魚的毒性等級，見表1。

2 結果(Results)

2.1 3種供試農藥及其復配劑對斑馬魚的24 h、48 h-LC50

3種農藥及其復配劑對斑馬魚的24 h、48 h毒性測定結果如表2所示，35%精甲霜靈懸浮種衣劑的5個試驗濃度處理組在24 h、48 h內斑馬魚未發生死亡，說明35%精甲霜靈懸浮種衣劑在24 h、48 h內對斑馬魚的LC50均大于100 a.i.mg·L-1。25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑在24 h、48 h內對斑馬魚的LC50分別是0.704 mg·L-1和0.514 mg·L-1。由此可以看出對斑馬魚25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑比35%精甲霜靈懸浮種衣劑毒性大。而80%嘧菌酯水分散粒劑在24 h、48 h內對斑馬魚的LC50分別是9.803 mg·L-1和5.175 mg·L-1；11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑在24 h、48 h內對斑馬魚的LC50分別是2.267 mg·L-1和2.073 mg·L-1。可以看出，11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑的3種組分中咯菌腈毒性最強，精甲霜靈最弱。所以11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑的毒性主要源于咯菌腈。

表1 毒性等級劃分標準Table 1 Toxicity grading standards

2.2 3種供試農藥及其復配劑對斑馬魚的72 h、96 h-LC50

3種農藥及其復配劑對斑馬魚的72 h、96 h毒性測定結果如表3所示，35%精甲霜靈懸浮種衣劑的5個試驗濃度處理組在72 h、96 h內斑馬魚仍未發生死亡，說明35%精甲霜靈懸浮種衣劑在72 h、96 h內對斑馬魚的LC50均大于100 a.i.mg·L-1，滿足LC50(96 h)>10.0 a.i.mg·L-1，屬“低毒”級。25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑在72 h、96 h內對斑馬魚的LC50分別是0.424 mg·L-1和0.262 mg·L-1，其LC50(96 h)在0.100～1.00 a.i.mg·L-1范圍內，屬于“高毒”級別。80%嘧菌酯水分散粒劑在72 h、96 h內對斑馬魚的LC50分別是4.328 mg·L-1和2.326 mg·L-1，其LC50(96 h)在1.00～10.0 a.i.mg·L-1范圍內，屬“中毒”級。11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑在72 h、96 h內對斑馬魚的LC50分別是1.62 mg·L-1和1.28 mg·L-1，其LC50(96 h)在1.00～10.0 a.i.mg·L-1范圍內，屬“中毒”級。雖然11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑和80%嘧菌酯水分散粒劑同屬“中毒”，但比較具體數值，發現11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑毒性相對更大，可能是因為其中含有“高毒”的咯菌腈。

3 討論(Discussion)

35%精甲霜靈懸浮種衣劑對斑馬魚的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50均超過10 a.i.mg·L-1，屬“低毒”級，而25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑對斑馬魚的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分別為0.704 mg·L-1、0.514 mg·L-1、0.424 mg·L-1、0.262 mg·L-1，根據0.100 a.i.mg·L-1

同一種農藥對不同的生物的毒性是不同的，沒有所謂的毒性一定更強的農藥，每種農藥的毒性作用機制不同導致它對不同生物毒性不同。因而在開發新的農藥時，除了要考慮對靶標生物的殺滅效果，滿足人們防治病蟲害的效果，還要考慮農藥對環境中其他生物可能的毒害作用，以免給生態環境帶來大的風險。同時應盡可能使用混劑，一方面可以減少各單劑的劑量，還可以達到多種效果，同時，人們還發現農藥混劑可以降低生物抗藥性[16]。可以在一定程度上緩解農藥用量快速增長，給生態環境帶來的巨大壓力。

致謝：該項目得到國家自然科學基金No.21477152和No.21277163的支持。

表3 “半靜態法”測得的3種農藥及其復配劑對斑馬魚的72 h、96 h-LC50Table 3 The 72 h and 96 h LC50 values of the studied pesticides to Brachydanio rerio by semi-static method

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◆

The Toxicity of Three Pesticides of Mefenoxam, Fludioxonil, Azoxystrobin and Their Compounds to Brachydanio rerio

Qu Weigang1, Yang Songlin2, Wang Huili2, Guo Baoyuan2,*

1. Institute for Control of Agrochemicals, Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

1 April 2016 accepted 23 May 2016

Semi-static method was applied to determine the 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values of three pesticides and their compounds to Brachydanio rerio. And according to experimental criteria for environmental safety evaluation of chemical pesticides in our country, the 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values of 35% mefenoxam seed coating agent are all above 10 a.i.mg·L-1so it is of low toxicity. 25 g·L-1fludioxonil seed coating agent is highly toxic because its 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values are 0.704 mg·L-1, 0.514 mg·L-1, 0.424 mg·L-1, 0.262 mg·L-1according to the standard of 0.100 a.i.mg·L-1

pesticide; Brachydanio rerio; acute toxicity; semi-static method

國家自然科學基金(21477152，21277163)

瞿唯鋼(1958-)，男，農藝師，研究方向為農藥環境毒理研究與農藥登記管理，E-mail: quweigang@gmail.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: guoby@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160401008

2016-04-01 錄用日期：2016-05-23

1673-5897(2017)2-233-05

X171.5

A

郭寶元(1976-)，副研究員，主要研究方向為農藥環境毒理學。

瞿唯鋼, 楊淞霖, 王會利, 等. 3種殺菌劑及其復配劑對斑馬魚的急性毒性[J]. 生態毒理學報，2017, 12(2): 233-237

Qu W G, Yang S L, Wang H L, et al. The toxicity of three pesticides of mefenoxam, fludioxonil, azoxystrobin and their compounds to Brachydanio rerio [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 233-237 (in Chinese)