氨態氮對菲律賓蛤仔毒理機制研究的內參基因篩選

曹滕飛，叢明，李兆艷，趙建民，呂家森，李成華

1. 寧波大學海洋學院，寧波 3152112. 中國科學院煙臺海岸帶研究所，煙臺 2640033. 煙臺大學生命學院，煙臺 264005

氨態氮對菲律賓蛤仔毒理機制研究的內參基因篩選

曹滕飛1，叢明2,，李兆艷3，趙建民2，呂家森3，李成華1

1. 寧波大學海洋學院，寧波 3152112. 中國科學院煙臺海岸帶研究所，煙臺 2640033. 煙臺大學生命學院，煙臺 264005

為了準確和系統地分析NH3-N對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)毒性的分子機制，并對相關基因的轉錄組學數據進行驗證，利用geNorm和Normfinder這2種軟件，以暴露30 d中不同時間點的鰓組織cDNA為模板，從18S rRNA (18S)、beta-actin (Actin)、beta-tubulin (Tubu)、elongation factor 1-alpha (EF1α)、cyclophilin A (CyPA)、Ubiquitin (Ub)等6個備選管家基因中，篩選可以穩定表達的內參基因，作為轉錄組學分析的內參基因。以稀釋50倍的鰓組織cDNA模板作為檢測模板，geNorm軟件分析獲得6對備選內參基因的表達穩定性依次為：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，較優內參為EF1α和CyPA；NormFinder軟件分析獲得6對備選內參基因的表達穩定性為：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，最優內參基因為EF1α。為了驗證上述篩選結果，分別以EF1α和CyPA作為內參基因研究unigene1的表達趨勢，發現以EF1α為內參基因時，unigene1的qRT-PCR的表達趨勢與其轉錄組表達倍數的變化趨勢一致。因此確定NH3-N暴露菲律賓蛤仔后，鰓組織中表達最為穩定的內參基因為EF1α。

氨氮；菲律賓蛤仔；內參基因

海岸帶是人類聚居的主要地帶之一，工業相對發達，人口也比較密集，工業和生活廢物給近岸海洋環境帶來很大的生態污染壓力。2010—2015年“中國近岸海域環境質量公報”公布的數據顯示，我國近岸局部海域海水環境污染情況比較嚴峻，無機氮一直都是首要的超標因子，而近岸海水中超過Ⅲ類標準限值的無機氮主要是氨氮[1-3]。2010年入海河流水質和污染物入海狀況顯示，氨氮超標率達到35.0%，氨氮平均濃度為1.82 mg·L-1[1]。“十二五”計劃已將氨氮列入減排的約束性指標，其污染狀況有所緩解，2011年入海河流的氨氮平均濃度下降到0.274 mg·L-1[2]。但是從2014和2015年的海洋環境質量狀況看，氨氮依然是自北向南很多海域包括海水重點養殖區的重要污染因子[3-4]。近岸海域是海洋養殖產業的黃金區域，氨氮污染也因而成為制約我國近岸海水養殖業(包括灘涂貝類養殖業)健康發展的主要污染因子。

國內對于氨氮的貝類生態毒理研究主要集中于傳統生態毒理學方面，包括氨氮污染物對貝類的致死率和生理生化反應等。王文琪等[5]對菲律賓蛤仔進行氨氮的急性毒性實驗，發現氨氮暴露24 h的半致死濃度為239.88 mg·L-1，氨氮污染對血淋巴細胞的數目和溶菌活力有顯著性影響。方軍等[6]發現毛蚶(Scapharca subcrenata)稚貝對氨氮具有較高的耐受性，在24 h、48 h、72 h、96 h的半致死濃度分別為96.33、74.16、43.63、20.36 mg·L-1，安全濃度為2.04 mg·L-1，氨氮濃度越高存活率越低；陳金鳳等[7]對文蛤的存活率和能量收支情況進行研究，發現總氨氮對文蛤的安全濃度范圍為2 mg·L-1，氨氮污染對文蛤的攝食能、呼吸能和排泄能都有影響。羅杰等[8]發現鹽度和pH值可以顯著影響氨氮對管角螺(Hemifusus tuba)的毒性，鹽度越低、pH值越高其毒性越強。Wang等[9]以20.0 mg·L-1的氨氮染毒櫛孔扇貝(Chlamys farreri)24 h，導致櫛孔扇貝死亡率顯著上升，過氧根離子和丙二醛含量也顯著上升，谷氨酰胺合成酶活性在暴露后12 d顯著上升。國外也有一些關于氨氮污染對養殖貝類危害的研究報道。Reddy-Lopata等[10]發現南非鮑魚(Haliotis midae)對氨氮的耐受性隨體重的增加而增強，長期暴露于亞致死量氨氮濃度下的鮑魚幼苗的生長率比未接觸氨氮的鮑魚幼苗減少超過50%；Keppler[11]以美洲牡蠣(Crassostrea virginica)為研究對象，發現氨氮濃度升高可以導致牡蠣消化腺和鰓組織細胞的溶酶體不穩定性顯著升高，同時谷胱甘肽濃度顯著下降。總之，目前大多數氨氮污染的研究集中于傳統毒理學的研究，氨氮毒性的分子機理研究較少。

本研究利用菲律賓蛤仔作為研究對象，采用環境污染相關濃度的氨態氮對菲律賓蛤仔進行短期(1 d)和長期(30 d)暴露，以期利用轉錄組學深入研究NH3-N污染對貝類短期和長期毒性的分子機制。轉錄組學(Transcriptome)是一門在整體水平上研究細胞中基因轉錄情況及轉錄調控規律的學科，也是最早發展起來并得到廣泛應用的組學技術[11]。細胞的功能從基因的轉錄開始，通過分析轉錄組，可高通量地獲得基因表達的RNA信息，揭示基因表達與一些生命現象之間的內在聯系。目前，轉錄組學技術在海洋貝類毒理學領域已得到初步的應用。Milan等[12]采集有機污染嚴重海域的菲律賓蛤仔，利用轉錄組學技術對其肝胰腺和鰓中RNA進行測序和歸類分析，從中獲得了很多與有機污染相關的基因信息。迄今，還未發現利用轉錄組學技術系統地研究氨氮污染對貝類的毒理學效應的報道。

根據氨氮的致毒途徑可知，氨氮主要通過水生動物的鰓組織進入體內，引起生理調節機制紊亂，即鰓是氨氮攻擊的第一靶組織[12-15]。因此，本文以菲律賓蛤仔的鰓組織作為研究對象，選取菲律賓蛤仔體內6個表達較為穩定的基因，包括核糖體(18S rRNA)、肌動蛋白基因(beta-actin)、微管蛋白基因(beta-tubulin)、轉錄延伸因子基因(elongation factor 1-alpha)、親環素基因(cyclophilin A)、泛素蛋白基因(Ubiquitin)等[16-18]，作為研究氨氮暴露菲律賓蛤仔的轉錄組學的候選內參基因。利用內參篩選軟件geNorm[19]和NormFinder[20]，對這些內參基因在氨氮暴露條件下的表達穩定性進行研究，以期為菲律賓蛤仔鰓組織的轉錄組學研究篩選穩定表達的內參基因。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

本實驗所用菲律賓蛤仔于2014年11月購于煙臺市萊山區佳世客超市，選取大小適宜、健康無病、生命力強、體態均勻(11±1.5) g的個體。實驗開始前，將蛤仔放入室內進行10 d暫養，暫養期間海水溫度(20±2.0) ℃，pH 8.0±0.1，鹽度30.0‰，全天曝氣供氧，每日定時換水(30個體/30 L過濾海水)、喂食(螺旋藻液)一次。

實驗所用氨態氮源為分析純NH4Cl(國藥集團化學試劑有限公司，上海)，配制1 mol·L-1母液100 mL。根據《漁業水質標準》(GB 11607—89)[21]規定，漁業養殖水體中非離子氨氮含量不應超過0.02 mg·L-1，但是我國近海的氨氮污染程度遠超過這一臨界值。我們前期研究發現，0.1 mg·L-1氨態氮可以對菲律賓蛤仔的溶酶體穩定性造成顯著性影響，但是在實驗條件下長期暴露不會造成蛤仔出現嚴重的死亡狀況，所以本研究設2個濃度組：對照組(Control，0 mg·L-1)，低濃度暴露組(Low，0.1 mg·L-1)，每組設3個重復，每個重復包含菲律賓蛤仔35只，水溫、投食、充氣等養殖條件與暫養條件一致。每日定時換水一次，并維持各組NH4Cl的質量濃度。在暴露后的第1和30天取樣，每組隨機取6只菲律賓蛤仔，取其鰓組織浸沒于Trizol中，-20 ℃保存，用于RNA提取及后續實驗。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按照Trizol(TaKaRa，大連)試劑盒說明書提取樣品的總RNA，NanoDrop 2000(Thermo Scientific, America)檢測RNA的濃度和純度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

RNA反轉錄成cDNA實驗采用EraserPrime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑盒，反應分為去除gDNA、反轉錄兩步，體系(20 μL)如下：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL；RT Primer Mix 1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4.0 μL；RNase Free ddH2O 4.0 μL；總RNA 1 μg；去除gDNA的反應液10 μL。反轉錄條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，產物-20 ℃保存。

1.3 引物設計及可用性驗證

根據本課題組對菲律賓蛤仔鰓組織的轉錄組測序結果，選擇18S rRNA (18S)、beta-actin (Actin)、beta-tubulin (Tubu)、elongation factor 1-alpha (EF1α)、Ubiquitin (Ub)、cyclophilin A (CyPA)等6個表達量較為穩定的基因作為備選管家基因。按照定量引物設計要求，利用Primer 5.0設計10對引物(表1)并由上海生工生物技術有限公司合成。

利用普通PCR反應驗證引物的可用性，反應體系(25.0 μL)為：10× PCR Buffer (Mg2+free) 2.5 μL；dNTP Mixture 2.0 μL；MgCl21.5 μL；Taq 0.25 μL；ddH2O 15.75 μL；正向引物1 μL；反向引物1 μL；不同時間點鰓組織的混合cDNA 1.0 μL。反應條件如下：94 ℃、5 min，(94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s)× 36 cycles，72 ℃、10 min，4 ℃存放。反應結束后用1%的瓊脂糖凝膠檢測各擴增片段的單一性(圖1)。

圖1 10對備選內參基因引物的特異性檢測電泳圖注：1為18S1；2為18S2；3為Actin；4為Tubu1；M為DL 2000 Marker；5為Tubu2；6為EF1α1；7為EF1α2；8為Ub1；9為Ub2；10為CyPA。Fig. 1 Ten couples of specific primers for 6 target reference genes examined by agarose gel electrophoresisNote: 1 stands for 18S1; 2 stands for 18S2; 3 stands for Actin; 4 stands for Tubu1; M stands for DL 2000 Marker; 5 stands for Tubu2; 6 stands for EF1α1; 7 stands for EF1α2; 8 stands for Ub1; 9 stands for Ub2; 10 stands for CyPA.

1.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)采用7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, America)進行，所用試劑盒SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, America)的反應體系(20.0 μL)如下：鰓組織稀釋(10、50、100、500、1 000倍)模板cDNA 5 μL；正向引物0.6 μL；反向引物0.6 μL；SYBR Select Master Mix 10 μL；ddH2O 3.8 μL。反應程序：50 ℃、20 s，94 ℃、7 min，(94 ℃、10 s，60 ℃、30 s)× 40 cycles。

1.5 數據分析

用7500 System Software(Applied Biosystems, America)觀察擴增曲線，將所得Ct值轉化為相對定量數據2-ΔΔCt[22]，并用geNorm和NormFinder軟件分別來分析基因的表達穩定性；采用Su等[23]的加權賦值方法，按照分數越小越穩定的原則，綜合確定最適合的內參基因。

1.6 內參基因驗證

以篩選出的內參基因，利用氨氮暴露1 d和30 d的菲律賓蛤仔鰓組織稀釋50倍的cDNA為模板，采用1.4 qRT-PCR的體系與分析方法，對轉錄組中unigene 1 (c112601_g1)的表達情況進行定量分析，獲得unigene 1在氨氮短期和長期暴露后的表達趨勢，通過與unigene 1的轉錄組學數據變化趨勢(log2FoldChange)相比較，驗證最優內參基因的可用性。

2 結果(Results)

2.1 RNA、引物和cDNA質量檢測

Nanodrop 2000檢測樣品RNA的OD260/280均在1.8～2.0之間，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有5S、18S、28S三條條帶，說明RNA質量符合qRT-PCR的要求。

用不同處理組鰓組織的混合cDNA對備選內參基因進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結果均為單一條帶，并且與預期長度一致(圖1)，其中6個基因的qRT-PCR結果顯示，溶解曲線都只有明顯的單一峰且重復性好(圖2)。因此，所用引物都能夠特異性地擴增其內參基因，且不存在引物二聚體，適用于qRT-PCR。舍棄同一基因的重復引物對，最后分別以18S1、Actin、Tubu1、EF1α1、Ub1和CyPA的正反向引物作為內參基因18S、Actin、Tubu、EF1α、Ub和CyPA的檢測引物。

表1 內參基因的引物序列信息Table 1 Primer sequences for housekeeping genes

圖2 6個備選內參基因擴增產物的溶解曲線Fig. 2 Melting curves of products from 6 reference genes

圖3 geNorm分析NH3-N暴露后內參基因表達的穩定性Fig. 3 Stability value of reference gene expression after NH3-N exposure by geNorm

2.2 cDNA濃度確定

根據預實驗結果，對樣品鰓組織cDNA模板進行梯度稀釋，稀釋倍數分別為10、50、100、500、1 000。根據各對引物的擴增效果，發現cDNA模板稀釋50倍時，除18S的Ct值在11.0左右外，其余各對內參基因的Ct值均在19.0～23.0范圍內，比較適合作為檢測的模板濃度。

2.3 內參基因的穩定性分析

2.3.1 geNorm軟件分析結果

通過對氨氮暴露不同時間的菲律賓蛤仔鰓組織cDNA進行qRT-PCR擴增，利用geNorm軟件分別分析18S、Actin、Tubu、EF1α、Ub和CyPA的2-ΔΔCt值，獲得其表達穩定性的平均值M，依次為0.94、0.53、0.63、0.30、0.79和0.31。根據M值越小基因表達穩定性越高，M值越大基因表達穩定性越低的運算原理，可得出6個候選內參基因的表達穩定性由高到低依次為：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，EF1α和CyPA為6個內參基因中表達相對較穩定的內參基因(圖3)。

geNorm軟件通過計算內參基因的配對差異值Vn/(n+1)來確定內參基因的合適數目。程序以0.15為默認取舍值，即如果Vn/(n+1)小于0.15，說明候選內參基因中有n個適合作為qRT-PCR的內參基因，沒必要引入第(n+1)個內參進行標準化校正[24]。本研究中Vn/(n+1)值均大于0.15 (圖3)，因此需要改變取舍條件后再確定內參基因的合適數目。

2.3.2 NormFinder軟件分析

根據NormFinder軟件分析獲得的穩定值(stability value)得知，6個備選內參基因的穩定性順序依次為：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，其最優的內參基因為EF1α(表2)。

2.3.3 綜合排名分析

根據geNorm和NormFinder這2種軟件分析結果的排名次序，采用Su等[23]的加權賦值方法，給每種分析方法中每個基因的表達穩定性賦值，最穩定為1分，其次依次為2、3、4、5、6分，然后把每個基因所得分數相加進行重新排序，分數越小越穩定。根據表3統計結果可以看出，18S的最后得分最高(12)，其他依次為Ub (10)，Tubu (7)，CyPA (6)，Actin (5)，最小為EF1α (2)。因此，綜合排名最穩定的基因為EF1α (表3)。

表2 NormFinder分析NH3-N暴露后的最優內參基因Table 2 The optimal reference gene after NH3-N exposure by NormFinder

2.4 內參基因的驗證結果

通過geNorm軟件分析發現，CyPA和EF1α都適合作為內參基因，但是通過NormFinder軟件分析發現EF1α是最佳內參基因，最后根據Su等[23]的綜合評價體系確定EF1α是最佳內參基因。為了驗證EF1α是最佳的內參基因，分別以CyPA和EF1α基因作為內參，以轉錄組中的unigene 1(c112601_g1)為研究對象，通過qRT-PCR技術，對其進行表達情況分析。結果(圖4)發現，以CyPA作為內參基因，unigene 1的表達呈現先下降后上升的趨勢；而以EF1α作為內參基因分析發現，unigene 1的表達趨勢為先上升后下降。后者與轉錄組學unigene 1的實際log2FoldChange表達趨勢一致，而前者與之不符。

圖4 以CyPA和EF1α作為內參研究目標基因的表達趨勢分析Fig. 4 Expression profiles of target gene 1 using EF1α and CyPA as reference gene respectively

表3 geNorm和NormFinder分析穩定值排名Table 3 Stability value ranking by geNorm and NormFinder

3 討論(Discussion)

篩選出具有特異性穩定表達的內參基因,是對轉錄組學的目標基因進行qRT-PCR分析的前提條件，通常情況下需要根據不同的實驗條件或不同類型的細胞或組織來進行比較選擇，近年來的研究結果發現，常用的內參基因均存在不穩定性，在qRT-PCR分析之前有必要對其穩定性進行重新評估[25]。如史艷艷等[26]研究在17α、20β雙羥孕酮(DHP)誘導鯉(Cyprinus carpio)卵母細胞最終成熟過程中，18S rRNA、28S rRNA、CTSZ、EF1α、GAPDH和β-actin 6個備選內參基因的表達情況，同時應用不同的內參分析軟件分析其表達穩定性，結果表明6個備選基因中表達最為穩定的是EF1α。劉穎等[27]選取了櫛孔扇貝性腺組織為研究對象，分析了β-actin、β-TUB、EFlα、18S rRNA和GAPDH 5個備選內參基因在不同發育階段和雌激素暴露條件下的表達水平，并應用RefFinder軟件進行數據分析，發現櫛孔扇貝不同發育階段和雌激素暴露下的表達最為穩定的內參基因是EFlα。王琦等[28]研究了合浦珠母貝(Pinctada fucata)不同組織、性腺發育時期、胚胎發育時期GAPDH、β-actin和18S rRNA 3個備選內參基因的表達穩定情況，并應用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析表達穩定性的差異，最終發現β-actin在不同組織和胚胎發育不同階段表達最穩定，18S rRNA在性腺發育不同時期表達最穩定。李迪等[29]研究了鱖魚(Siniperca chuatsi) 8個不同胚胎發育階段、5個胚后發育時期和8個成魚組織中RPL13、RPL19、EF1α、RPL13α、B2M、hprt1和rps29 7個備選內參基因mRNA水平的表達穩定情況，geNorm軟件分析后發現，不同發育階段的穩定表達的內參基因不同：在不同胚胎發育階段中表達最穩定的是EF1α和B2M，在胚后不同時期中表達最穩定的是EF1α和RPL13α，在鱖魚成魚不同組織中表達最穩定的是B2M和RPL13α。

本研究采用2種軟件geNorm和NormFinder對菲律賓蛤仔體內6對常用的備選內參基因的表達穩定性進行獨立研究，其中由geNorm軟件可以得到內參基因的穩定性順序，基因表達的穩定值M越小其穩定性越高；還可以通過標準化因子的配對差異分析(Vn/Vn+1)判定內參基因的最適數量，默認值為0.15 (Vn/Vn+1<0.15時不必使用內參數量> n+1的看家基因作為內參)。由軟件分析結果(圖3)可以看出，NH3-N暴露菲律賓蛤仔后，6個備選內參基因在鰓組織中表達穩定性依次為：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，EF1α和CyPA是表達最為穩定的2個內參基因。另一方面，各組的Vn/Vn+1都大于0.15，按照geNorm軟件設定的默認條件Vn/Vn+1≤0.15來取舍，應該選擇≥n+1個看家基因來做內參，不過geNorm操作手冊中也提到0.15也非其最大設定值。由于本次實驗設定的暴露時間范圍(0～30 d)跨度大，樣本間基因表達差異較大，所以可以選擇1個或者2個較優的管家基因作為內參基因，而不必拘泥于Vn/Vn+1≤0.15，蔣婷婷等[30]在篩選石蒜屬植物的內參基因實驗中也遇到了類似的問題。

NormFinder是由Andersen等2004年開發的另一款用于篩選穩定內參基因的軟件，其運行結果以穩定值的大小排序。與geNorm相似的是，NormFinder中表達穩定值越小意味著該基因表達越穩定。此外，NormFinder運算結果中還提示最優的內參基因。本研究實驗條件下，各內參基因在鰓組織中的表達穩定性從高到低的排序為：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，最優的內參基因為EF1α。

由于geNorm和NormFinder軟件的篩選結果中存在一定的差異，因此需綜合2種軟件的排序結果來統一分析。在這里采用Su等[23]的加權賦值方法，按照分數越小越穩定的原則，綜合確定最適合的內參基因。分析得出內參基因表達穩定性綜合排序為：EF1α>Actin>CyPA>Tubu>Ub>18S，這一結果中EF1α最為穩定。從而，進一步確定出在氨氮暴露后的鰓組織中最優的內參基因為EF1α。

為了驗證上面的篩選結果，我們以轉錄組中隨機一個unigene(c112601_g1)為對象，利用EF1α和CyPA作為內參基因，對目的基因的表達趨勢進行驗證(圖4)。qRT-PCR結果和轉錄組學數據比對后，發現以EF1α作為其內參基因獲得的表達趨勢和實際轉錄組獲得數據的變化趨勢一致，但CyPA并非如此。由此可知，菲律賓蛤仔受到氨態氮暴露后，EF1α可以作為最佳的內參基因進行鰓組織轉錄組學分析。

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◆

Selection of Reference Genes for Toxicological Mechanism Research onRuditapesphilippinarumExposed to Ammonia Nitrogen

Cao Tengfei1, Cong Ming2,, Li Zhaoyan3, Zhao Jianmin2, Lv Jiasen3, Li Chenghua1

1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China3. College of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China

27 July 2016 accepted 28 August 2016

In order to analyze the transcriptome data accurately and systemically, a suitable reference gene is necessary. In the present study, geNorm and Normfinder softwares were used to analyze the expression stabilities of six candidate reference genes of Ruditapes philippinarum after ammonia nitrogen exposure for 30 days. The reference genes included 18S rRNA (18S), beta-actin (Actin), beta-tubulin (Tubu), elongation factor 1-alpha (EF1α), cyclophilin A (CyPA) and Ubiquitin (Ub). Based on a 50-times diluted cDNA in gills as the quantitative real-time PCR template, the geNorm software analysis demonstrated that the expression stabilities of the six candidate reference gene after NH3-N exposure were as follows: EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S, and EF1α and CyPA were the best two ones among the six reference genes. A little different order was detected by the NormFinder software as follows: EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S. And EF1α was recommended as the optimal reference gene. As an assay, EF1α and CyPA were employed to examine one target unigene by qRT-PCR respectively. Final results showed that the variation trend detected by EF1α was more consistent with the foldchange value of the transcriptome. So EF1α was selected as the housekeeping gene to analyze the transcriptome data of gills in Ruditapes philippinarum after ammonia nitrogen exposure.

ammonia nitrogen; Ruditapes philippinarum; reference gene

國家自然科學基金(41406132)

曹滕飛(1992-)，男，碩士，研究方向為生態毒理和分子生物學，E-mail: caotengfei2012@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mcong@yic.ac.cn；

10.7524/AJE.1673-5897.20160727001

2016-07-27 錄用日期：2016-08-28

1673-5897(2017)2-182-09

X171.5

A

叢明(1976-)，女，海洋生物學專業，博士，助理研究員，主要研究方向為海岸帶生態毒理和分子生物學。

曹滕飛, 叢明, 李兆艷, 等. 氨態氮對菲律賓蛤仔毒理機制研究的內參基因篩選[J]. 生態毒理學報，2017, 12(2): 182-190

Cao T F, Cong M, Li Z Y, et al. Selection of reference genes for toxicological mechanism research on Ruditapes philippinarum exposed to ammonia nitrogen [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 182-190 (in Chinese)