吡啶硫酮金屬對華美盤管蟲(Hydroides elegans)精子DNA的損傷效應

陳新，李紫薇，覃宗敏，商群，唐敏,*

1. 海南大學材料與化工學院，?？?5702282. 海南大學環境與植物保護學院，?？?570228

吡啶硫酮金屬對華美盤管蟲(Hydroides elegans)精子DNA的損傷效應

陳新1，李紫薇2，覃宗敏1，商群1，唐敏1,*

1. 海南大學材料與化工學院，?？?5702282. 海南大學環境與植物保護學院，?？?570228

吡啶硫酮銅(CuPT)和吡啶硫酮鋅(ZnPT)在滲出型海洋防污涂料中的應用日益廣泛，其生態毒性引起了人們的關注。本文以南海海域常見優勢種——華美盤管蟲(Hydroides elegans Haswell)為試驗動物，采用彗星實驗研究了吡啶硫酮金屬對華美盤管蟲精子細胞DNA的損傷情況。結果顯示，低濃度(4 μg·L-1CuPT或8 μg·L-1ZnPT)處理組的精子細胞，其“彗星”尾長、尾DNA含量及Olive尾矩都顯著高于溶劑對照組(P<0.05)；較高濃度(8 μg·L-1或16 μg·L-1CuPT，16 μg·L-1或32 μg·L-1ZnPT)處理組的精子細胞，其“彗星”尾長和尾矩多數顯著高于溶劑對照組(P<0.01)。此外，尾長和Olive尾矩在試驗濃度范圍內都呈現“效應-濃度”正相關。CuPT為4 μg·L-1、ZnPT為8 μg·L-1時，對精子DNA造成輕度損傷；CuPT為8 μg·L-1、16 μg·L-1，ZnPT為16 μg·L-1、32 μg·L-1時，則達到了中度損傷的程度?？梢娺拎ち蛲饘倬哂休^明顯的海洋生態遺傳毒性；另一方面，華美盤管蟲精子細胞DNA對吡啶硫酮金屬的脅迫呈現出較高的敏感性和效應-濃度相關性，在作為生態遺傳毒性的生物指標方面具有潛在優勢，進一步的研究將促進其在海洋重金屬污染評價中的應用，特別是用于南海海洋環境的早期預警監測。

吡啶硫酮金屬；華美盤管蟲；精子；生態遺傳毒性

海洋資源開發已經成為眾多沿海國家發展戰略的重要組成部分，我國制定的“十三五”規劃和“一帶一路”建設目標，使海洋成為開拓發展的新空間，為我國經濟和社會發展提供了更多的契機。然而，值得關注的是隨之帶來的一系列海洋生態環境問題亟待解決，這在我國一些局部海域非常嚴峻。其中重金屬污染問題特別突出，它在海洋環境中殘余時間長、生物毒性效應明顯、沿食物鏈易富集、難以治理，對海洋生物和人類健康危害性很高，一直是海洋生態環境學領域研究的熱點之一[1]。特別是很多有機重金屬，例如有機汞和有機錫[2-3]都曾給海洋生態和人類健康帶來過嚴重危害。近來吡啶硫酮金屬在海洋防污產品應用廣泛，作為防污助劑的含量通常占10%以上[4-5]，同時也因其優良的抗菌性能大量應用于抗菌防霉涂料、護發去屑品等化工產品中[6]。已有研究表明吡啶硫酮鋅對淡水生物麥穗魚、青鳉、直突搖蚊亞科2齡幼蟲屬劇毒物質[7]，對海水多毛類Dinophilus gyrociliatus的生存和生殖都會帶來負面影響[8]。為了及時而客觀地評價吡啶硫酮金屬的生態風險，有必要對其進行系統而全面的生態毒性研究。

華美盤管蟲(Hydroides elegans)屬管棲多毛類，分布廣泛，生活史短，在我國南海全年都能繁殖、附著，且易在實驗室養殖，對很多污染物敏感，是較理想的生態毒性檢測生物[9-13]。此外，熱帶海洋多毛類華美盤管蟲是南海污損生物群落常見優勢種，在當地防污工作方面備受關注。Bao等[9]研究了無機銅、吡啶硫酮銅(CuPT)、吡啶硫酮鋅(ZnPT)、敵草隆對華美盤管蟲擔輪幼蟲的急性毒性作用，發現48 h半致死濃度(LC50)分別為100、5.7、7.6、16 000 μg·L-1；重金屬也會阻礙華美盤管蟲受精過程，導致發育停止，以及胚胎及幼蟲出現畸形發育，華美盤管蟲不同生命階段對重金屬表現出不同的敏感性[10-12, 14]；此外，華美盤管蟲配子受精及胚胎發育對氟氯青霉素也較敏感[15]；Thilagam等[16]利用處于早期生命階段的華美盤管蟲作為指示生物，評價了印度東海岸不同水域的生態毒性現狀。上述研究大多集中在毒物對華美盤管蟲個體生長發育的影響，對其生態遺傳毒性方面的報道很少。已知環境中具有遺傳毒性的物質會損傷生物的遺傳物質，加大生物的遺傳負荷，從而給生物種群以及生態系統的遺傳方面帶來深遠的負面影響，所以水生生態遺傳毒性的研究在水質質量監測和生態風險評價中具有重要意義[17]。

目前對DNA損傷程度進行檢測的遺傳毒性方法主要分為2類：(1)從DNA損傷引起的生物學效應來進行檢測，如染色體畸變、細胞突變分析、微核試驗等；(2)直接對DNA損傷進行檢測，如單細胞凝膠電泳(也稱為彗星實驗)、沉降技術、洗脫技術等。其中單細胞凝膠電泳應用最為廣泛，實驗操作較簡單、快速靈敏，可在單個細胞水平檢測DNA損傷[18-19]，在生態遺傳毒性檢測領域有很好的應用前景[20-22]，在溞、軟體動物、魚等水生生物的多種細胞中獲得了較滿意的檢測結果[23-24]。但是在水生生態遺傳毒性研究和應用過程中，彗星實驗在程序標準化、提高結果重復性、增強結果的可比性、從機理角度進行結果解釋等方面還需進一步的優化和完善。Sunjog等[25]分別使用鰱魚(Squalius cephalus L.)紅細胞、鰓細胞和肝細胞進行彗星實驗以檢測河水及水庫淡水的潛在遺傳毒性，發現彗星尾矩和尾長度是評價DNA損傷的靈敏參數。Pellegri等[17]研究了大型溞(Daphnia magna)血淋巴細胞彗星實驗的操作程序，期望加快其在淡水生態遺傳毒性檢測的標準化進程。另外，Speit等[26]認為使用生殖細胞進行遺傳毒性研究具有更重要的意義。

本文以海洋多毛類華美盤管蟲為實驗動物，利用彗星實驗研究了吡啶硫酮金屬對華美盤管蟲精子DNA的損傷情況，以了解CuPT和ZnPT對華美盤管蟲的遺傳毒性效應，探討CuPT和ZnPT對華美盤管蟲精子的毒性作用機理，期望為加快無脊椎動物生殖細胞彗星實驗在海洋生態遺傳毒性領域的應用以及在結果解釋方面提供參考資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

實驗用華美盤管蟲成體采集于海南陵水黎安灣(18°30′N，110°01′E)，年平均水溫為25.5 ℃，鹽度為35‰，pH為8.2。

參照文獻[10]方法培養華美盤管蟲成體，先用過濾(0.45 μm)后的采集地海水，次日及以后均采用人工海水(所用海鹽購于青島海之鹽水族科技公司)半量換水進行培養。連續充氣，每日早晚投餌1次，餌料為牟式角毛藻(Chaetoceros muelleri)(海南大學海洋學院藻種室提供)，密度約為5×104cells·mL-1，每天觀察并記錄華美盤管蟲及其水質狀態。

1.2 實驗方法

1.2.1 獲取華美盤管蟲精子

采取機械方式破壞華美盤管蟲棲息的石灰質管，因應激反應[10-11]處于繁殖成熟期的蟲體在數分鐘內會釋放大量配子。用400目篩網過濾精子溶液，再用冷凍離心機離心2次(SIGMA 3k-18，4 000 r·min-1，2 min)，去上層液體，將精子用適量過濾海水重懸。血球計數板計數，用過濾海水稀釋到6×104sperm·μL-1。

1.2.2 精子染毒處理

利用二甲基亞砜(DMSO, Sigma-Aldrich Co. LLC)作為助溶劑分別配制1 g·L-1的CuPT和ZnPT(上海廣拓化學)母液，避光保存。試驗時采用人工配制海水稀釋到相應濃度。實驗所用試劑均為分析純。

企業應制定簡潔的工作流程，這也是提高工作效率、縮短時間成本的一項措施。拖沓冗長的環節程序不僅會降低工作效率，還會影響外界與企業的正常銜接，產生不必要的時間成本。

分別吸取50 μL精子溶液(6×104sperm·μL-1)，暴露于不同濃度的待檢溶液中，參照文獻[10]數據，CuPT和ZnPT分別設定3個濃度處理組，CuPT濃度為4.00、8.00、16.00 μg·L-1，ZnPT濃度為8.00、16.00、32.00 μg·L-1，海水為空白對照組，DMSO為溶劑對照組(0.07 mL·L-1)。參考美國環境保護署(EPA)對無脊椎動物海膽精子的毒性試驗[27-28]，選擇室溫黑暗條件下染毒處理1 h后，離心(4 000 r·min-1，22 ℃，2 min)，棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶液，混勻。取少量精子細胞懸浮液進行臺盼藍染色，計算細胞存活率。

1.2.3 彗星試驗

實驗步驟參照文獻[29]方法稍作修改。以1%正常熔點瓊脂糖和0.7%低熔點瓊脂糖在磨砂載玻片上鋪膠，三層膠中底膠為正常熔點瓊脂糖，中層為混合細胞的低熔點瓊脂糖，上層為低熔點瓊脂糖。在4 ℃條件下凝固后，在新鮮配制并預冷的細胞裂解液(2.5 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Na2EDTA，10 mmol·L-1Tris，0.2 mmol·L-1NaOH，體積分數為10%的DMSO，體積分數為1%的TritonX-100，pH=10)中，4 ℃避光裂解4 h。隨后用預冷的去離子水充分漂洗。在20 V、300 mA條件下電泳20 min。

在0.4 mmol·L-1Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液，4 ℃條件下中和15 min。取出載玻片后，采用SYBR Green I(Invitrogen)染液避光染色。使用熒光顯微鏡(OLYMPU BX51)，選擇波長495 nm，進行細胞觀察和拍照。每一對照組和處理組都在200×下隨機統計分析50個細胞圖像，利用CASP軟件分析，測量彗星細胞的頭長和全長、尾長和尾矩。

1.3 數據統計與分析

用Excel 2010進行數據整理，利用SPSS 19.0分析實驗組與對照組各相關數據。數據結果顯示為平均值±標準誤差(用誤差線顯示)，P < 0.05、P < 0.01為差異顯著。

2 結果(Results)

華美盤管蟲精子細胞的臺盼藍染色結果顯示細胞存活率為92.4%～95.8%，細胞密度為2×106cells·mL-1，細胞存活率和密度達到了彗星實驗要求。

在熒光顯微鏡下觀察對照組和各處理組精子細胞(圖1)，發現空白對照組的精子核緊密而集中，邊緣較清晰，尾部很短或沒有出現明顯的尾部(圖1A)；溶劑對照組的精子核形態與和空白對照類似(圖1B)。CuPT處理組(C～E)和ZnPT處理組(F～H)的“彗星”尾長與溶劑對照組相比明顯變大，且不同毒物處理組隨著毒物濃度的增加都出現“彗星”頭部變小、頭部亮度變弱、尾長增加，同時尾部熒光強度逐漸增強的趨勢。

海水空白組(圖2中以0表示)和溶劑對照組(圖2中以DMSO表示)精子細胞的“彗星”尾長、尾DNA含量及Olive尾矩均無顯著差異。處理組中較低濃度(4 μg·L-1CuPT和8 μg·L-1ZnPT)的精子細胞的“彗星”尾長、尾DNA含量及Olive尾矩顯著高于溶劑對照組(P<0.05)，處理組中較高濃度(8 μg·L-1和16 μg·L-1CuPT，16 μg·L-1和32 μg·L-1ZnPT)的精子細胞，其“彗星”尾長、尾DNA含量和尾矩多數是顯著(P<0.01)高于溶劑對照組的(圖2)。分別比較CuPT和ZnPT處理組的精子細胞“彗星”的尾長、尾DNA含量和尾矩，可見尾長、尾DNA含量和尾矩在試驗濃度范圍內都呈現效應-濃度正相關，相關系數r在0.985～0.996范圍內。CuPT為4 μg·L-1、ZnPT為8 μg·L-1時，彗星尾DNA百分比含量分別為15.16%和16.69%，按照Anderson等[30]對DNA損傷的分級標準，達到了輕度損傷的程度；CuPT為8 μg·L-1、16 μg·L-1，ZnPT為16 μg·L-1、32 μg·L-1時，彗星尾DNA百分比含量分別為23.38%、34.96%和27.30%、37.83%，則達到了中度損傷的程度。

圖1 華美盤管蟲精子細胞彗星圖像(×200)注：A-海水空白組；B-溶劑對照組；C, D, E分別為4 μg·L-1、8 μg·L-1和16 μg·L-1 CuPT處理組；F, G, H分別為8 μg·L-1、16 μg·L-1和32 μg·L-1 ZnPT處理組。Fig. 1 The comet image of sperms of Hydroides elegans (×200)Note: A-the blank; B-solvent control; C, D, E stand for the treatment groups with 4 μg·L-1, 8 μg·L-1 and 16 μg·L-1 of CuPT respectively; F, G, H stand for the treatment groups with 8 μg·L-1, 16 μg·L-1, 32 μg·L-1 of ZnPT, respectively.

3 討論(Discussion)

從實驗結果可知，與空白對照相比，助溶劑DMSO在實驗濃度范圍對精子DNA損傷無顯著影響；在CuPT和ZnPT的脅迫下，華美盤管蟲精子細胞DNA損傷顯著提高，并且隨著CuPT和ZnPT濃度的增加，精子細胞DNA損傷程度提高，兩者呈正相關。

圖2 CuPT/ZnPT對華美盤管蟲精子細胞DNA的損傷作用注：*、**與對照組比較差異顯著P<0.05、P<0.01。Fig. 2 DNA damage of Hydroides elegans sperm following the exposure to CuPT/ZnPTNote: Compared with the control, *, ** stand for the significant differences at the level P<0.05, P<0.01.

重金屬對動物細胞DNA的損傷機制目前還未完全解析，有專家研究認為重金屬誘導自由基是DNA損傷一個重要因素，已知重金屬會破壞或抑制很多動物的抗氧化防御系統，導致自由基增加，自由基攻擊DNA鏈而導致DNA分子斷裂，在不能及時修復的情況下出現DNA片段[36]；此外，彗星實驗已應用于抗氧化劑效應檢測，這也進一步肯定了自由基對DNA的損傷作用[37]；CuPT和ZnPT對華美盤管蟲的抗氧化系統具有較明顯的影響，抗氧化系統受損后不能及時清除過多的自由基[38]，故推測本實驗中CuPT和ZnPT對DNA的損傷效應與抗氧化系統受損和自由基的積累是密切關聯的。對于吡啶硫酮金屬對華美盤管蟲的生態毒性效應及其機理，還有待更加深入的研究，如吡啶硫酮金屬在華美盤管蟲體內的輸送和代謝規律、吡啶硫酮金屬及其代謝物與生物活性大分子物質的相互作用、吡啶硫酮金屬的聯合毒性以及與其他污染物對華美盤管蟲的復合效應等。在此領域的深入研究，有望為探索無脊椎動物在海洋環境監測以及防污劑生態遺傳毒性評價中作為實驗動物提供參考數據。

彗星實驗在脊椎動物遺傳毒性檢測方面的研究和應用較多，對無脊椎動物的研究相對較少，而且多采用體細胞[39-41]。海洋環境中無脊椎動物種類豐富，數量龐大，是海洋生態系統中最主要的消費者，在物質循環和能量流動過程中承擔重要作用。體外受精現象在海洋無脊椎動物繁殖過程中普遍存在，釋放到體外的精子直接與海水接觸，易受到環境中有毒物質的影響。若在環境因子的脅迫下無脊椎動物精子DNA的完整性受到破壞，將不可避免地影響到精子的健康和存活，進而限制該動物種群的發展，并可能由此對局部區域生態系統的健康和可持續發展產生潛在的深遠影響。所以，以海洋無脊椎動物精子細胞作為遺傳毒性檢測對象具有明顯的優勢。本實驗采用彗星實驗，以南海近岸常見的無脊椎動物——華美盤管蟲精子細胞為遺傳毒性檢測對象，發現較低濃度的CuPT(8 μg·L-1)或ZnPT(8、16 μg·L-1)即可對華美盤管蟲精子細胞DNA產生中度損傷，呈現出較高的敏感性，這在南海海洋生態環境評價中具有一定的現實意義，也為今后發展合理快速的生態遺傳毒性檢測方法提供參考資料。

綜上所述，利用彗星實驗研究了CuPT和ZnPT對華美盤管蟲精子細胞DNA的損傷情況。結果表明，一定濃度CuPT和ZnPT均能引起華美盤管蟲精子細胞DNA的損傷，并且在一定范圍內，尾長、尾DNA含量和Olive尾矩與吡啶硫酮金屬濃度呈明顯的劑量-效應關系，即隨著濃度增大，對精子細胞DNA的損傷程度明顯增加；華美盤管蟲精子細胞對CuPT的敏感性高于ZnPT。CuPT為4 μg·L-1、ZnPT為8 μg·L-1時，對DNA造成輕度損傷；CuPT為8 μg·L-1、16 μg·L-1，ZnPT為16 μg·L-1、32 μg·L-1時，則達到了中度損傷的程度。對于吡啶硫酮金屬對華美盤管蟲的生態毒性機理還有待進一步的深入探究，這將促進其作為生物標志的應用進程。

致謝：感謝海南大學分析測試中心；感謝邱立國、朱秀琴等同學在試驗中給予的幫助，特別感謝審稿專家和編輯提出的寶貴意見。

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The Effects of Metal Pyrithione on Sperm DNA of PolychaeteHydroideselegans

Chen Xin1, Li Ziwei2, Qin Zongmin1, Shang Qun1, Tang Min1,*

1. College of Material and Chemical Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China2. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China

13 October 2016 accepted 2 December 2016

The application of copper pyrithione (CuPT) and zinc pyrithione (ZnPT) are increasingly widespread in exudation antifouling coatings, and their potential ecotoxicity has attracted a plethora of concerns. In this paper, the effects of CuPT and ZnPT on sperm DNA damage of Hydroides elegans were investigated by comet assay. Results indicated that in groups with low concentration of CuPT (4 μg·L-1) or ZnPT (8 μg·L-1), the length of comet tail, DNA contents in tail, and comet Olive tail moment were significantly greater than that of the control (P<0.05), and also those in the higher concentration groups (CuPT at 8 μg·L-1or 16 μg·L-1, ZnPT at 16 μg·L-1or 32 μg·L-1) were significantly greater than that of the control (P<0.01). A positive “concentration-effect” relationship was observed within the concentration range of this experiment. When CuPT and ZnPT were at 4 μg·L-1and 8 μg·L-1, respectively, DNA damage occurred in a slight degree, while at 8 μg·L-1and 16 μg·L-1CuPT or 16 μg·L-1and 32 μg·L-1ZnPT, moderate DNA damage was detected, indicating that CuPT and ZnPT could have obvious ecogenotoxicity in marine environment. In addition, the results also illustrated that Hydroides elegans sperm were sensitive to stress caused by CuPT and ZnPT, and therefore such test can be considered as a potential biomarker for ecogenotoxicity assessment of marine pollution caused by heavy metals, especially for early alert in the South China Sea.

metal pyrithione; Hydroides elegans; sperm; ecogenotoxicity

國家自然科學基金項目(31360105，31660128，31160098)

陳新(1973-)，男，講師，研究方向為海洋環境與生態毒理，E-mail: 982912387@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: 1251054716@qq.com

10.7524/AJE.1673-5897.20161013001

2016-10-13 錄用日期：2016-12-02

1673-5897(2017)2-201-08

X171.5

A

唐敏(1972-)，女，博士，副教授，主要研究方向為水生生態學，發表學術論文40余篇。

陳新, 李紫薇, 覃宗敏, 等. 吡啶硫酮金屬對華美盤管蟲(Hydroides elegans)精子DNA的損傷效應[J]. 生態毒理學報，2017, 12(2): 201-208

Chen X, Li Z W, Qin Z M, et al. The effects of metal pyrithione on sperm DNA of polychaete Hydroides elegans [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 201-208 (in Chinese)