白念珠菌CDR1/CDR2和MDR1基因高表達對氧化應激的影響

蔣 玲，趙亞婧，李水秀，宋延君，郭 慧，朱坤舉，張 宏

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白念珠菌CDR1/CDR2和MDR1基因高表達對氧化應激的影響

蔣 玲，趙亞婧，李水秀，宋延君，郭 慧，朱坤舉，張 宏

目的 探索白念珠菌CDR1/CDR2和MDR1基因高表達對氧化應激的影響。方法 以白念珠菌CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株及其親本株為研究對象，測定過氧化氫(H2O2)對菌株生長的影響。以H2O2建立氧化應激模型，比較各菌株細胞內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，ΔΨm)、氧化應激相關基因(CAP1和GRP2)和ROS清除相關基因(SOD2和SOD5)轉錄水平的差異。結果 各菌株均在5 mmol/L H2O2作用時出現100%生長抑制；H2O2能升高細胞內ROS和降低ΔΨm(P<0.05)，其中高表達株中兩者的變化幅度較親本株低(P<0.05)；同時高表達株中CAP1和GRP2基因在轉錄水平的表達上調以及SOD2和SOD5基因的下調也較親本株少(P<0.05)。結論CDR1/CDR2和MDR1基因高表達能夠降低白念珠菌的氧化應激反應，增強其對氧化應激的適應性。

白念珠菌;CDR1/CDR2基因;MDR1基因; 高表達; 氧化應激

近年來白念珠菌病的發病率不斷上升，雖然有多種抗真菌藥物應用于臨床，但耐藥現象愈來愈多，耐藥程度也越來越高[1]。白念珠菌耐藥性的產生與多種因素有關，當前研究發現最主要的機制是ATP結合蛋白轉運盒多藥外排轉運子的編碼基因CDR1和CDR2的過度表達，易化載體超家族基因MDR1的過度表達[2]。此外有研究表明白念珠菌的耐藥產生于對抗真菌藥物的高適應性，同時也是白念珠菌對環境適應的一種體現[3]。某些抗真菌藥物，如唑類藥物，已被證實可通過誘導氧化應激反應而殺傷真菌，其耐藥性的產生也有可能是白念珠菌對氧化應激反應的適應，不同耐藥程度的菌株對氧化應激可能作出不同的反應[4-5]。因此，本文選取同一親本來源的親本株和CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株，在過氧化氫(H2O2)模擬的氧化應激環境下，測定這兩組菌株抵抗H2O2氧化刺激的差異，氧化損傷的主要指標，以及氧化應激相關基因和活性氧(ROS)清除相關基因轉錄水平表達情況，探討CDR1/CDR2和MDR1基因高表達對白念珠菌氧化應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 受試菌株(見表1)為來自于艾滋病合并口咽念珠菌病患者的白念珠菌(瑞士洛桑大學微生物研究所Sanglard教授惠贈)。質控菌株為美國臨床和實驗室標準協會(CLSI) 推薦的克柔念珠菌 ATCC6258和近平滑念珠菌 ATCC22019。

1.1.2 試劑、培養基、主要儀器 H2O2(北京普博欣生物科技有限公司，純度30%), 四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)，2′, 7′-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA，美國sigma公司)，PBS緩沖液(北京普博欣生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO, 美國Sigma公司)，真菌細胞線粒體膜電位熒光測定試劑盒(上海杰美基因(GenMed)醫藥科技有限公司)，真菌RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Fungal RNA Kit)(美國Omega公司)，反轉錄試劑盒(日本TakaRa公司)。YEPD 液體培養基(含1% 酵母抽提粉，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，美國BD公司)，YEPD 固體培養基(含1% 酵母抽提粉，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，2% 瓊脂，美國BD公司)，RPMI-1640液體培養基(美國Gibco公司, pH 7.0)。酶標儀(680型，美國BIORAD 公司)，Gallios 流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，TECAN 全波長多功能酶標儀(奧地利 Tecan 公司)，Mini-sub CELL GT電泳儀(美國 BIORAD 公司)，凝膠成像系儀(美國 BIORAD 公司)，Q-PCR 儀(美國 BIORAD 公司)。

表1 受試菌株
Tab.1 Strains used in this study

菌株Strain親本株Parentstrain過度表達基因OverexpressiongenesFLC的MIC(μg/mL)MICofFLC(μg/mL)參考文獻ReferenceDSY2940.256DSY296DSY294CDR1andCDR2646DSY2900.57DSY292DSY290MDR11287

注：MIC：最低抑菌濃度

Note: MIC, minimum inhibitory concentration

1.2 方法

1.2.1 菌株培養 從4 ℃保存的YEPD固體培養基上挑取白念珠菌單克隆于YEPD液體培養基中，在30 ℃、200 r/min振蕩培養，活化16 h后用于實驗。1.2.2 試劑配置 H2O2用無菌蒸餾水配置成5 mol/L 的儲備液； DCFH-DA用DSMO溶解，配置成2 mg/mL的儲備液。兩種試劑儲備液分別過濾分裝后, -20 ℃保存備用。MTT用PBS緩沖液配制成5 mg/mL的儲備液, 4 ℃避光保存。

1.2.3 H2O2對白念珠菌生長抑制的測定 先用RPMI-1640液體培養基調節菌液濃度為2倍工作濃度(1～5)×103CFU/mL，將H2O2藥物儲備液稀釋至2倍工作濃度(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 mmol/L)，取其100 μL依次加入96孔板的第2 ～ 11列，第1列為生長對照, 不加藥液, 而以100 μL RPMI-1640液體培養基代替；第12列為空白對照, 加入200 μL RPMI-1640液體培養基；除第12列外，其余各孔再分別加入100 μL菌懸液。30 ℃恒溫培養24 h，然后加5 mg/mL的MTT作用3～4 h,將各孔上清吸出100 μL，再加DMSO培養20 min，用酶標儀測定OD570值, 結果表示為，與生長對照孔比較，生長活性100%完全抑制，培養基清亮時，所對應的最低藥物濃度即為H2O2對白念珠菌生長抑制所需最低濃度。

1.2.4 DCFH-DA 染色檢測細胞內ROS 白念珠菌培養同上，調節細胞濃度至2.5×106CFU/mL，加入5 mmol/L H2O2作用，30 ℃培養6 h。藥物處理后，將細胞用PBS洗滌3次，并重懸至1×107CFU/mL，加入DCFH-DA 使其終濃度為20 μg/mL，30 ℃孵育20 min。將染色好細胞用PBS洗滌3次后，用Gallios流式細胞儀檢測平均熒光強度, 該值即代表ROS水平，激發波長為485 nm，發射波長520 nm。

1.2.5 線粒體膜電位(ΔΨm)檢測 將活化好的白念珠菌菌懸液調整濃度為2.5×106CFU/mL，用5 mmol/L H2O2處理6 h。藥物處理后，應用GENMED真菌細胞線粒體膜電位熒光測定試劑盒進行檢測，調節菌濃度為1×107CFU/mL，GENMED清理液洗滌3次后，加入500 μL GENMED染色工作液(JC-1染色劑：10 μg/mL)，30 ℃避光培養20 min，將細胞用GENMED清理液洗滌2次，取200 μL轉移至黑色96孔板。應用全波長多功能酶標儀進行熒光雙重測定，激發波長490 nm，獲得紅色熒光單位(散發波長590 nm)和綠色熒光單位(散發波長530 nm)。ΔΨm由紅色與綠色熒光的比值來確定。

1.2.6 RNA的提取和cDNA合成 活化后白念珠菌調節濃度為2.5×106CFU/mL，5 mmol/L H2O2作用6 h。藥物處理后，調節細胞濃度為1.5×107CFU/mL，取1 mL，按照真菌RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，放入-80 ℃冰箱中保存備用。按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書先去除基因組DNA，再進行反轉錄，合成的cDNA產物放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.7 引物合成和qRT-PCR 引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。18sRNA、CAP1、GRP2、SOD2和SOD5的引物序列根據參考文獻合成[8-9]，見表2。qRT-PCR采用SYBR○RPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)的標準步驟進行。反應條件：95 ℃預變性10 s；95 ℃ 變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，重復40個循環。55 ～ 95 ℃每 1 s 讀取一次熔解曲線。以18sRNA作為內參標準，結果應用Light Cycler system software version 3.5(Roche Diagnostics) 軟件系統進行分析。以不加藥組各個基因的表達量作為對照，計算基因H2O2處理后各個基因mRNA轉錄水平的相對表達量，各個基因的相對表達量用倍數變化來表示(2-(ΔΔCt)法)。

表2 基因CAP1、GRP2、SOD2和SOD5所需引物序列
Tab. 2 Primer lists ofCAP1,GRP2,SOD2 andSOD5

PrimerSequence(5'-3')18S-FTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGG18S-RTCGATAGTCCCTCTAAGAAGTGCAP1-FACCGTGAAGGTAAAGAACGCAP1-RGCTACCACCAGTATATTTAGCCGRP2-FTTCGTTTCTGGTGCTTCTGRP2-RTTTGTGGTCCATGAGTTTSOD2-FAACTTGGCTCCTGTCTCSOD2-RTATCACCATTGGCTTTGSOD5-FACATTGGCGGTTTATCSOD5-RATTACCTTGAGGAGCA

2 結 果

2.1 H2O2對白念珠菌生長抑制的影響 結果顯示H2O2對這2組白念珠菌生長活性完全抑制對應的最低濃度值均為5 mmol/L，沒有顯示出CDR1/CDR2和MDR1基因高表達對菌株抵抗H2O2所模擬的氧化應激的能力差異。

2.2 ROS生成的差異 如圖1所示，不加藥物作用下，親本株與CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株的ROS無明顯差異(P>0.05)；而在H2O2作用后，各菌株細胞內的ROS水平明顯高于空白對照組(P<0.05)；且與對應親本株相比，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株中ROS生成較少(P<0.05)，分別只有親本株的0.34倍和0.49倍。

2.3 ΔΨm降低的差異 如圖2所示，不加藥物作用下，親本株與CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株的ΔΨm無明顯差異(P>0.05)，在H2O2作用下，白念珠菌的ΔΨm比空白對照組明顯降低(P<0.05)；且CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株中ΔΨm比親本株高 (P<0.05)，表明其ΔΨm下降程度較親本株少。

2.4 氧化應激相關基因和ROS清除相關基因轉錄水平表達差異 如圖3所示，H2O2作用下，氧化應激相關基因CAP1和GRP2轉錄水平的相對表達量在各菌株中均有上調(P<0.05)，其中，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株的上調較親本株少(P<0.05)，表明其氧化應激反應低于親本株； ROS清除相關基因SOD2和SOD5轉錄水平的相對表達量在各菌株中均有下調(P<0.05)，其中，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株的下調較親本株少(P<0.05)，表明其細胞內ROS清除作用高于親本株。

數據以3次獨立實驗數據的形式表示 * P<0.05The data display the ±s from three independent experiments * P<0.05圖1 流式細胞術DCFH-DA染色檢測H2O2對親本株、CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株ROS的影響Fig.1 Effect of H2O2 on ROS of parent strains and CDR1/CDR2 or MDR1 genes overexpressed strains were assessed by flow cytometry using DCFH-DA

數據以3次獨立實驗數據的形式表示 *P<0.05The data display the ±s from three independent experiments * P<0.05圖2 JC-1染色檢測H2O2對親本株、CDR1/CDR2和MDR1基因高表達株膜電位的影響Fig.2 Effect of H2O2 on ΔΨm of parent strains and CDR1/CDR2 or MDR1 genes overexpressed strains were assessed by JC-1 staining

數據以3次獨立實驗數據的形式表示The data display the ±s from three independent experiments圖3 qRT-PCR 測定不加藥或5 mmol/L H2O2處理后白念珠菌基因CAP1(A)、GRP2(B)、SOD2(C)和SOD5(D) 的表達水平Fig.3 qRT-PCR analysis of the expression levels of CAP1(A), GRP2(B), SOD2(C) and SOD5(D) in C. albicans which treated or untreated with 5 mmol/L H2O2

3 討 論

白念珠菌的耐藥性是目前臨床上系統性白念珠菌感染治療失敗的主要原因之一。當機體感染白念珠菌時，細胞免疫占主導地位[10]，主要是通過吞噬細胞的呼吸爆發產生活性氧物質而殺傷白念珠菌，而白念珠菌對氧化損傷的耐受可以導致免疫逃逸，進一步促進感染的形成[11]，其臨床治療也會越困難。因此，本文旨在探討不同耐藥程度的白念珠菌在耐受氧化應激能力上存在的差異，從而為抗真菌治療提供一個新的途徑。

本研究選定白念珠菌藥物外排泵基因CDR1/CDR2和MDR1高表達且對唑類藥物耐藥的菌株和對應的親本株為研究對象，發現所有菌株對H2O2的耐受性無差異。這可能是因為實驗使用的菌濃度和培養基都較少，H2O2為很強的殺菌劑，在這樣的情況下它能夠在極低的濃度下殺死白念珠菌。同時在5 mmol/L H2O2模擬的氧化應激環境下，我們發現CDR1/CDR2和MDR1基因高表達能夠減少ROS的生成。某些抗真菌藥物可以通過使真菌處于大量ROS的內外環境而殺傷真菌[4-5]。而真菌過度表達藥物外排基因，增加藥物外排的過程也就是消除氧化源的過程,是對抗真菌藥物引起的氧化刺激最有效的手段。因此,藥物外排泵基因CDR1/CDR2和MDR1高表達能夠減少氧化刺激下白念珠菌細胞內ROS水平。其次，實驗還發現CDR1/CDR2和MDR1基因高表達能夠減少白念珠菌ΔΨm的下降。正常白念珠菌細胞中存在著完備的氧化和抗氧化系統，處于氧化還原平衡狀態。當輻射、細胞毒性藥物等破壞了氧化還原的平衡態時，ROS的生成超過了抗氧化防御的能力，細胞就會進入氧化應激狀態。當細胞產生輕度的氧化應激時，在藥物作用下細胞會表現出一定的耐藥性。但大量的則會導致強烈的氧化損傷反應，如線粒體功能障礙，從而降低了ΔΨm[12]。所以，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達在減少細胞內ROS生成后，同時也能減少ΔΨm的下降。

有文獻報道，CAP1基因既與白念珠菌的耐藥性相關，又與氧化應激相關[13-14]，GRP2基因編碼丙酮醛還原酶，能單獨或通過CAP1基因引起氧化應激反應。SOD2和SOD2基因編碼超氧化物歧化酶，清除細胞內ROS，是抗氧化應激反應的第一道防線[15]。CDR1/CDR2和MDR1基因高表達通過減少CAP1和GRP2基因表達的上調，降低了白念珠菌引起氧化應激的能力；同時，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達通過減少SOD2和SOD5基因表達的下調，增加了菌株細胞內ROS的清除，減少了其積聚，從而減少氧化應激反應。qRT-PCR的結果與細胞內ROS和ΔΨm測定結果是一致的。

由此可知，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達能夠降低白念珠菌細胞內的氧化應激反應，增加其對氧化應激環境的適應性。白念珠菌的耐藥也是對細胞內外環境的適應，尋找新的抗氧化應激作用的藥物與當前耐藥的抗真菌藥物聯合使用，有可能為解決白念珠菌的耐藥問題提供新思路。

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Effect ofCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpression on oxidative stress inCandidaalbicans

JIANG Ling, ZHAO Ya-jing, LI Shui-xiu, SONG Yan-jun, GUO Hui, ZHU Kun-ju, ZHANG Hong

(TheFirstAffiliatedHospital/InstituteofMycology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

To investigate the effect ofCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpression on oxidative stress inCandidaalbicans, we evaluated the effect of H2O2on cell viability inC.albicansoverexpressing genesCDR1 /CDR2 orMDR1 and their parent strains. After establishing an oxidative stress model with H2O2, we detected reactive oxygen species (ROS)，mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and the expression of oxidative stress response-related genes (CAP1 andGRP2) and ROS clearance related-genes (SOD2 andSOD5). The results showed thatC.albicansgrowth were inhibited by 100% after the treatment of 5 mmol/L H2O2. H2O2caused more ROS accumulation and ΔΨm reduction in parent strains than inCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpressed strains (P<0.05). Compared to parent strains, the up-regulated expression ofCAP1 andGRP2 were relatively less inCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpressed strains, moreover, the down-regulated expression ofSOD2 andSOD5 were also relatively less inCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpressed strains (P<0.05). In conclusion, the overexpression ofCDR1/CDR2 andMDR1 genes could reduce the oxidative stress response and enhance the adaptability ofC.albicansto oxidative stress.

Candidaalbicans;CDR1/CDR2 gene;MDR1 gene; overexpression; oxidative stress

s: Zhang Hong, Email: tzhangh@jnu.edu.cn;Zhu Kun-ju, Email: zhukunju1111@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.003

國家自然科學基金(No. 81171542/81471995)

張 宏，Email：tzhangh@jnu.edu.cn； 朱坤舉，Email: zhukunju1111@163.com

暨南大學附屬第一醫院/暨南大學真菌病研究所，廣州 510632

R378

A

1002-2694(2017)06-0486-05

2016-11-10 編輯：張智芳

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81171542 / 81471995)