海藻色素糖蛋白對胃癌細胞抑制作用的體內外研究

郎曉輝，鐘進義，孫曉虹，嚴吉峰，周佳靜

（1.山東省煙臺護士學校，山東 煙臺 264000；2.青島大學醫學院，山東 青島 266021；3.煙臺市中醫醫院，山東 煙臺 265699）

海藻色素糖蛋白對胃癌細胞抑制作用的體內外研究

郎曉輝1，鐘進義2，孫曉虹1，嚴吉峰1，周佳靜3

（1.山東省煙臺護士學校，山東 煙臺 264000；2.青島大學醫學院，山東 青島 266021；3.煙臺市中醫醫院，山東 煙臺 265699）

目的 觀察麒麟菜海藻色素糖蛋白（SPG）對胃癌細胞增殖活性的抑制作用。方法 將不同濃度SPG與人MGC803胃癌細胞共同培養，用四甲基偶氮噻唑藍（MTT）法測定胃癌細胞增殖活性。將SPG經口給予皮下接種MFC細胞株的小鼠，10天后取胃癌組織，用MTT法測定不同劑量組小鼠胃癌細胞的增殖活性，免疫組化法檢測不同劑量組小鼠胃癌細胞內PCNA蛋白的表達。結果 體外實驗結果顯示高劑量SPG組與腫瘤對照組48h細胞增殖活性分別為0.531±0.008和0.857±0.011，差異有統計學意義（P＜0.05）。體內實驗結果顯示高劑量SPG組細胞增殖活性及PCNA蛋白陽性表達率分別為0.698±0.028和16.30%，腫瘤對照組分別為1.122±0.032和62.06%，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 SPG對胃癌細胞增殖活性有抑制作用。

海藻色素糖蛋白（SPG）；胃癌細胞；增殖活性

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 細胞株與實驗動物

人MGC803胃癌細胞株、MFC細胞株購自上海研域生物科技有限公司；昆明種健康小鼠由山東魯抗醫藥實驗中心提供，每只體重18～20 g，本實驗室內適應性喂養一周。

1.2 實驗樣品

SPG是從新鮮干燥麒麟菜中以乙醇浸提法制取，由本實驗室自行制備，經紫外分光光度法測定，純度＞90%。

1.3 試劑與儀器

PCNC多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；RPMI1640培養基、四甲基偶氮噻唑藍（MTT）和胎牛血清為美國GiBco公司產品；Rosys Anthos2010自動型酶標儀是瑞典產；Olympus XDS-1B型倒置顯微鏡為日本產。

1.4 方法

1.4.1 體外實驗

用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基將處于對數生長期的MGC803人胃癌細胞配成瘤細胞密度為5×105/mL的細胞懸液，以每孔100 uL的量接種于96孔培養板上?？瞻讓φ战M加入等量雙蒸水，高、中、低劑量組分別加入濃度為50、100、200 mg/L的SPG，各組均設置3個平行樣本。放置于5%CO2、37℃培養箱中培養48 h，加入MTT等試劑待其反應，經自動酶標儀于490 nm處測定吸光度（A）值，而后求取吸光度（A）的平均值，用平均A值表示各組細胞增殖活性，細胞增殖抑制率=（空白對照組A值-實驗組A值）/空白對照組A值×100%[3]。

1.4.2 體內實驗

用生理鹽水調整MFC細胞濃度為1×107/mL，于健康昆明種小鼠右側腋窩處進行皮下接種，每只接種量為0.2 mL，共接種40只，于接種后24 h，將40只小鼠隨機分為4組，每組10只，雌雄各半，分別為腫瘤對照組及高、中、低劑量SPG組。每日上午10時經口灌胃一次，腫瘤對照組給予生理鹽水，高、中、低劑量SPG組則分別50、100、200 mg/kg的SPG溶液，連續10天，末次給藥24 h后脫頸椎處死小鼠，對小鼠瘤組織于無菌條件下進行剝離，用1.4.1中方法測定培養24 h后的胃癌細胞增殖活性，用免疫組化法檢測小鼠瘤組織中PNCA蛋白的表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析，計數資料采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 體外實驗結果

200和100 mg/L SPG組，培養48 h的細胞增殖活性分別為0.531±0.008和0.613±0.021，空白對照組為0.857±0.011，差異有統計學意義（P＜0.05），各組間差異具有顯著性。見表1。

表1 SPG對MGC803人胃癌細胞增殖活性影響的體外實驗結果（±s）

表1 SPG對MGC803人胃癌細胞增殖活性影響的體外實驗結果（±s）

注：與空白對照組比較 α P＜0.05，與高劑量組比較β P＜0.05

38.04 28.47 7.58 -組別吸光度A值 抑制率（%）高劑量組中劑量組低劑量組空白對照組0.531±0.008α0.613±0.021α,β0.792±0.003α,β0.857±0.011

2.2 體內實驗結果

2.2.1 小鼠MFC胃癌細胞增殖活性

高劑量SPG組為0.698±0.028，腫瘤對照組為1.122±0.032，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 SPG對小鼠胃癌細胞增殖活性影響的體內實驗結果（±s）

表2 SPG對小鼠胃癌細胞增殖活性影響的體內實驗結果（±s）

注：與腫瘤對照組比較α P＜0.05，與高劑量組比較βP＜0.05

37.79 27.54 7.13 -組別吸光度A值抑制率（%）高劑量組中劑量組低劑量組腫瘤對照組0.698±0.028α0.813±0.020β1.042±0.069 1.122±0.032

2.2.2 PNCA蛋白表達結果

增殖細胞核抗原PCNA，呈棕黃色顆粒，在細胞核內表達。實驗結果顯示高劑量SPG組的胃癌細胞內PNCA蛋白呈陽性表達的細胞數少，染色多淺淡；腫瘤對照組的胃癌細胞內PNCA蛋白呈陽性表達的細胞數多，染色大多濃重。高劑量SPG組和腫瘤對照組胃癌細胞內PNCA則分別為16.48%和62.06%，差異有統計學意義（P＜0.05），兩者差異具有顯著性。見表3。

表3 瘤細胞PNCA蛋白的陽性表達率（%）

3 討 論

海藻色素糖蛋白（Seaweed pigment glycoprotein，SPG）是海藻中一種硫酸多糖與藻膽蛋白天然結合的色素糖蛋白。近年來有研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化等生物學活性。本研究采用體內實驗與體外實驗相結合的方法，觀察其對胃癌細胞增殖的影響。

本研究用四甲基偶氮噻唑藍（MTT）法測定細胞增殖活性水平，其吸光度A值與細胞的代謝活性成正比。體內外實驗結果均顯示：SPG組吸光度A值較之腫瘤對照組低，統計分析差異有顯著性，且存在劑量反應關系，高劑量組更低于中劑量組，說明SPG對胃癌細胞增殖活性具有一定的抑制作用。

增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）在細胞核內表達，是DNA合成過程中多聚酶的輔助蛋白，其表達狀況可以反映細胞增殖狀態[7]。PCNA表達的強弱與DNA合成活躍度呈正比關系，PCNA表達越強，說明DNA合成越活躍，PCNA表達減弱，說明DNA合成減弱。本研究體內實驗結果顯示，SPG組PCNA表達的陽性率較之腫瘤對照組低，統計分析差異有顯著性，且存在劑量反應關系，高劑量組低于中劑量組，中劑量組低于低劑量組，說明SPG具有抑制胃癌細胞增殖的作用。

綜合本次研究的體內外實驗結果：SPG在降低胃癌細胞的增殖活性和PCNA蛋白表達水平方面有作用。本研究中實驗數據顯示的結果與之前文獻報道的有關藻膽蛋白可抑制腫瘤細胞增殖活性的實驗結果相一致。

[1] 鐘進義,等.海藻光敏色素糖蛋白對乳腺癌細胞侵潤轉移的抑制作用及信號調控的研究[A].中國環境誘變劑學會.中國科學技術協會第十屆年會21分會場論文匯編[C].中國環境誘變劑學會:2008:5.

[2] 楊 青,等.海藻色素糖蛋白對肝癌細胞Caspase-3和Bax蛋白表達的影響(英文)[J].現代生物醫學進展,2011,(09):1771-1774.

[3] 郎曉輝,等.明日葉查爾酮對小鼠H22肝癌細胞增殖活性的抑制作用[J].生態毒理學報,2011,(03):261-264.

本文編輯：趙小龍

R735.7

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ISSN.2095-8242.2017.21.4021.02