干酪乳桿菌對HepG2細胞抗氧化功能的影響

陳 佩，黨 輝

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西廣播電視大學，益生菌功能及應用協同創新中心，陜西 西安 710119；3.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062；4.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

干酪乳桿菌對HepG2細胞抗氧化功能的影響

陳 佩1,2，黨 輝3,4

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西廣播電視大學，益生菌功能及應用協同創新中心，陜西 西安 710119；3.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062；4.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

目的：研究干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）對氧化應激狀態下HepG2細胞抗氧化功能的影響。方法：將培養的HepG2細胞分為3 組：對照組（不加H2O2）、模型組（加入H2O2）、乳桿菌組（加入干酪乳桿菌和H2O2）。細胞培養至12 h和24 h時分別測定其上清液和細胞裂解液的抗氧化活性。利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚對HepG2細胞進行染色，在熒光顯微鏡下觀察不同處理對細胞形態的影響。結果：添加干酪乳桿菌12 h后，與模型組相比，細胞上清液中的總抗氧化力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力分別提高了80%、30%和124%（P＜0.05），細胞裂解液中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力顯著增加了22%（P＜0.05）；24 h后，細胞上清液中的T-AOC、SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力和過氧化物酶的活力都顯著增加（P＜0.05），還原型谷胱甘肽和丙二醛的含量分別顯著降低了29%和63%（P＜0.05）。細胞裂解液中SOD活力比模型組顯著降低了20%（P＜0.05）。加入干酪乳桿菌后，細胞受損數量明顯減少，降低了56%，大部分細胞形態正常。結論：在體外條件下，干酪乳桿菌可以提高氧化應激狀態下HepG2細胞的抗氧化能力。

干酪乳桿菌；HepG2細胞；抗氧化；氧化應激；細胞裂解液

陳佩, 黨輝. 干酪乳桿菌對HepG2細胞抗氧化功能的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 220-224. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711035. http://www.spkx.net.cn

CHEN Pei, DANG Hui. Effect of Lactobacillus casei on antioxidant function of HepG2 cells[J]. Food Science, 2017, 38(11): 220-224. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711035. http://www.spkx.net.cn

機體在新陳代謝過程中會產生許多活性氧[1]，當體內自由基含量過高時，其與生物大分子結合可造成機體損傷，可引發癌癥、關節炎、心血管等疾病[2-3]。氧化應激會導致機體的各種組織和器官的功能逐漸下降，加速機體衰老和死亡，因此老化的速度可通過氧化損傷的衰減被延遲[4]。依據自由基老化理論，可以利用抗氧化劑中斷產生活性氧的反應[5]，但是長期使用抗氧化劑會給機體帶來一系列的副作用，如高血糖、高血壓和癌癥等。因此尋找開發更安全有效的天然抗氧化劑是非常必要的[6]。

乳酸菌是指發酵糖類且主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。乳酸菌具有一系列特殊的生理功能，如調節機體腸道菌群平衡[7]、增強免疫力[8]、改善血脂血糖[9-10]、延緩衰老[11]等。尤其近年來，乳酸菌的抗氧化功能得到了廣泛的研究。大量研究表明，乳酸菌在體內外實驗中均表現出很好的抗氧化活性，例如Lin等[12]研究了19 株乳酸菌都具有還原能力，能夠抑制抗壞血酸的自動氧化。任大勇等[13]從15 株乳酸菌中篩選出了兩株抗氧化能力強的菌株，表明這兩株乳酸菌在減輕機體氧化損傷方面具有一定的應用價值。Zhang Shuwen等[14]從傳統酸奶中分離得到的兩株乳桿菌均具有良好的抗氧化能力。體外篩選出的具有抗氧化作用的干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌，在大鼠體內也表現出很好的抗氧化活性[15-16]。

本實驗的干酪乳桿菌，是在前期研究中使用化學方法篩選出的具有較好抗氧化能力的菌株[17]。本研究擬通過HepG2細胞模型，研究干酪乳桿菌對氧化應激狀態下細胞抗氧化活性的影響，為以后體內研究及抗氧化機理方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞系HepG2細胞株 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；干酪乳桿菌 江南大學食品生物技術中心菌種保藏庫。

4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、二甲基亞楓（dimethyl sulphoxide，DMSO） 美國Sigma公司；DMEM低糖培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium）、0.25%胰酶（含0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））、胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸 美國Gibico公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒 武漢博士得生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CO2細胞培養箱 美國Thermo Electron Corporation公司；SW-CJ-1CV超凈臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；5415R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；恒溫培養箱上海一恒科技有限公司；VCX500超聲波破碎儀 美國Sonics&Materials公司；UV-2450紫外-可見分光光度計日本島津公司；CX41-12C02倒置顯微鏡 日本Olympus公司；DM2000顯微鏡 德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌菌種活化

將凍存于－80 ℃的乳桿菌接入MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h，連續活化3 代后用于后續實驗。

1.3.2 乳桿菌的菌液制備

乳桿菌活菌液制備：將培養好的乳桿菌在4 ℃條件下以6 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）離心洗滌3 次，濃度調節為1×109CFU/mL。

1.3.3 細胞培養

將HepG2細胞按常規方法復蘇后，置于含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1%雙抗的低糖DMEM培養液中，37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養，隔天更換一次培養液，待細胞貼壁融合率達80%左右時，用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化細胞，按1∶3傳代。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.4 H2O2對HepG2細胞氧化損傷模型的建立

參照文獻[18]的方法有所改動，將對數生長期中的HepG2細胞按照2×105個/mL接種到96 孔板中，每孔100 ?L，37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后，加入含H2O2終濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L的DMEM培養液，作用2 h，棄上清液，以3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法檢測細胞活力并以此建立氧化損傷模型。

1.3.5 MTT法檢測細胞存活率

參照文獻[19]的方法有所改動，96 孔板中每孔加入5 g/L MTT 40 ?L，37 ℃、5% CO2，孵育4 h，吸出培養液，每孔加入150 ?L的DMSO溶解結晶，37 ℃培養箱中放置10 min，確保紫色結晶充分溶解，酶標儀測定各孔在570 nm波長處的吸光度。按下式計算細胞存活率（R）。

式中：A1為實驗組的吸光度；A0為對照組的吸光度。

1.3.6 實驗分組

參照文獻[20]的方法有所改動，用0.25%的胰蛋白酶消化收集生長處于對數生長期的HepG2細胞以2×105個/mL的細胞密度接種于6 孔培養板，每孔2 mL培養液，37 ℃、5% CO2培養24 h。分組處理：對照組，加入2 mL DMEM培養液；模型組，加入含0.10 mmol/L H2O2的DMEM培養液；乳桿菌組，同時加入含0.10 mmol/L H2O2的DMEM培養液和干酪乳桿菌菌液（1×109CFU/mL），繼續培養12 h和24 h。

1.3.7 樣品收集

細胞繼續培養12 h和24 h后吸取培養上清裝入離心管，－80 ℃凍存備用。每孔用PBS洗滌3 次，然后每孔加1 mL 1%的Triton X-100用吸管充分吹勻，2 000 r/min 離心15 min，收集上清液即為細胞裂解液，－80 ℃凍存備用。1.3.8 指標測定

T-AOC、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、CAT活力、POD活力、MDA含量測定操作方法均按照試劑盒說明書進行。

1.3.9 細胞形態觀察

參照文獻[21]的方法有所改動，將HepG2細胞以2×105個/mL的密度接種于6 孔培養板，培養24 h使細胞爬片，后進行實驗（造模及乳桿菌處理），實驗結束后，PBS洗滌3 次，避光加入DAPI工作液（1 μg/mL）淹沒平皿底部，染色20 min后，PBS漂洗3 次后封片，最后用熒光顯微鏡觀察。

1.4 數據分析

實驗平行3 組，重復3 次。數據統計采用SPSS 16.0軟件進行one-way ANOVA，Tukey’s多重檢驗（P＜0.05均為有統計學意義），數值以±s表示。

2 結果與分析

2.1 H2O2對HepG2細胞存活率的影響

表1 不同濃度H對HepG2細胞存活率的影響O 22Table 1 Effect of different doses of Hon HepG2 cell survival O 22

H2O2作為一種外源性活性氧，特別容易穿透細胞膜導致DNA損傷，這種損傷在適宜的保護劑作用下，還可以被修復[22]。由表1可以看出，與對照組相比，0.05 mmol/L濃度的H2O2對細胞存活率的損傷不顯著，當H2O2濃度為0.10 mmol/L時，細胞存活率顯著下降到80.74%（P＜0.05）。濃度為0.20、0.25、0.30 mmol/L時，細胞存活率與對照組相比都呈顯著下降趨勢（P＜0.05），并且細胞存活率與H2O2的劑量呈現負相關性。因此，本實驗選用H2O2濃度為0.10 mmol/L建立細胞損傷模型。丁逍等[23]選用濃度為0.30 mmol/L的H2O2建立了大鼠睪丸間質細胞氧化損傷模型，施紅敏等[24]選用濃度為0.60 mmol/L的H2O2建立了PC12細胞損傷模型。由此可見針對不同的細胞建立氧化損傷模型時，選用的H2O2濃度也有所不同。

2.2 干酪乳桿菌對HepG2細胞培養上清液抗氧化功能的影響

T-AOC是一個全面反映機體抗氧化能力的指標，它包括酶促與非酶促兩個體系，這兩個體系之間相互協同發揮抗氧化的作用[25]。機體中清除自由基的系統主要包括SOD、GSH、GSH-Px和CAT等抗氧化物質，它們能夠阻斷自由基的鏈式擴大反應，有效保護細胞免受傷害。研究發現在人體腸道中，有一部分乳酸菌會被裂解并釋放出胞內物質，如GSH-Px和SOD，當乳酸菌被裂解后，這些抗氧化酶向周圍環境釋放并發揮抗氧化作用[26]。POD主要存在于細胞的過氧化物酶體中，對細胞具有保護作用。MDA是脂質過氧化的產物，它的含量直接反映體內脂質過氧化程度。有研究表明乳酸菌可以提高體內GSH的含量，降低MDA的含量，具有很強的抗氧化能力[27]。

表2 HepG2細胞上清液在12 h和24 h時的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of culture supernatants at 12 and 24 h

從表2可以看出，與對照組相比，12 h時，模型組細胞上清液中的T-AOC有所下降但差異不顯著，POD活力顯著降低（P＜0.05），GSH-Px活力增加了54.09 U/mL，SOD、CAT活力和MDA含量無顯著性差異，表明此時模型組細胞還未進入氧化應激狀態，說明此時細胞自身尚能夠通過提高GSH-Px活性來促進GSH清除H2O2，以防護機體不受氧化損傷。24 h后，細胞上清液中模型組的T-AOC比對照組顯著降低了50%（P＜0.05），GSH-Px活力顯著降低51%（P＜0.05），同時MDA含量顯著增加130%（P＜0.05），表明此時細胞已表現為氧化應激狀態，引起脂質過氧化損傷，導致細胞活性降低。楊瑞華等[28]研究表明添加0.10 mmol/L H2O2可使細胞中的MDA含量顯著升高（P＜0.05），此與本實驗結果一致。與模型組相比，添加干酪乳桿菌12 h后，細胞上清液中的T-AOC、GSH-Px活力和CAT活力都有顯著提高，分別提高了80%、30%和124%（P＜0.05），SOD活力有所提高，但并不顯著（P＞0.05），POD活力顯著降低了40%（P＜0.05），MDA含量增加了24%，表明干酪乳桿菌可以提高細胞抗氧化能力，但是對細胞也有一定的刺激作用。24 h后，細胞上清液中的T-AOC和SOD活力顯著增加了193%和139%（P＜0.05），GSH-Px、CAT和POD活力顯著增加（P＜0.05），GSH和MDA含量分別顯著降低了29%和63%（P＜0.05）。有研究顯示乳酸菌具有高效清除羥自由基和超氧化陰離子自由基的能力[29]，并可提高人體SOD和GSH-Px活力，降低腸道氧化應激，增強抗氧化能力[30]。本實驗結果表明干酪乳桿菌提高了抗氧化酶的合成和分泌，增強了細胞的抗氧化能力。

2.3 干酪乳桿菌對HepG2細胞裂解液抗氧化活性的影響

表3 細胞裂解液在12 h和24 h時的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of cell lysate at 12 and 24 h

如表3所示，添加干酪乳桿菌12 h后，與對照組相比，模型組細胞裂解液中SOD活力、GSH含量有所降低，但差異不顯著（P＞0.05）；POD活力顯著提高了109%（P＜0.05）。結果表明此時細胞剛開始受到刺激，胞內POD活力增加以保護細胞免受損傷。12 h后，乳桿菌組的細胞裂解液中SOD活力與對照組相比有所升高但無顯著性差異（P＞0.05），與模型組相比顯著增加了22%（P＜0.05）；POD活力與對照組相比顯著增加了118%（P＜0.05），和模型組相比也有所增加；GSH含量與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。表明此時細胞受到乳桿菌的氧化刺激作用，胞內的氧化酶含量隨之升高。24 h后，與對照組相比，模型組細胞裂解液中的SOD活力和GSH含量分別顯著增加了43%和71%（P＜0.05）；POD活力也有所增加；乳桿菌組的SOD活力比對照組有所增加，但比模型組顯著降低了20%（P＜0.05）；POD活力比對照組和模型組分別顯著增加了129%和108%（P＜0.05）；GSH含量比對照組顯著增加了83%（P＜0.05），與模型組相比也有所增加。結果表明，此時模型組的細胞已受到強烈的氧化應激，細胞內的抗氧化物開始大量合成，以保護細胞免受損傷。另外，干酪乳桿菌通過刺激提高細胞內抗氧化酶的活力，增強了細胞的抗氧化作用，對細胞有一定的保護作用。李盛鈺等[31]研究發現植物乳桿菌C88可提高Caco-2細胞的抗氧化酶活性，具有較強的抗氧化活性，此結果與本研究一致。

2.4 干酪乳桿菌對HepG2細胞形態學的影響

圖1 熒光顯微鏡下HepG2細胞核形態（10×40）Fig. 1 Morphology of nuclei in HepG2 cells examined by fluorescence microscope (10 × 40)

DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料，它可以通過完整的細胞膜，用于活細胞的染色。從圖1可看出，通過DAPI染色后在顯微鏡下可以明顯看出HepG2細胞經過不同處理后，細胞的形態變化。圖1A顯示正常細胞的核DNA與DAPI特異性結合，呈現均勻彌漫的熒光，細胞核輪廓清晰可見，呈圓形或橢圓形，細胞質無熒光。從圖1B可看出經過H2O2損傷后，細胞形態明顯改變，顯微鏡下呈現致密濃染的塊狀凝聚強熒光，細胞皺縮，體積變小呈不規則形狀。如圖1C所示，加入干酪乳桿菌后，細胞受損明顯降低了56%，少數細胞發生凋亡，其細胞核發出強熒光，但大部分細胞形態正常，呈現均勻彌漫的熒光。此結果與前文結果相符，即反映出干酪乳桿菌具有抗氧化的能力，能夠減少H2O2對HepG2細胞的損傷。

3 結 論

本研究結果表明，干酪乳桿菌對H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激模型具有一定的抗氧化效果，可通過提高抗氧化酶活力以提高細胞的總抗氧化能力，從而減輕細胞的損傷。說明干酪乳桿菌是具有較好抗氧化功能的益生菌，下一步可進行動物體內的抗氧化研究。

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Effect of Lactobacillus casei on Antioxidant Function of HepG2 Cells

CHEN Pei1,2, DANG Hui3,4
(1. School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China; 2. Collaborative Innovation Center for Function and Application in Probiotics, Shaanxi Radio & TV University, Xi’an 710119, China; 3. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China; 4. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective: This experiment was conducted to study the effect of Lactobacillus casei on antioxidant function of HepG2 cells under oxidative stress. Methods: HepG2 cells were randomly divided into 3 groups: control, model (H2O2induced oxidative stress) and treatment (H2O2plus Lactobacillus casei) groups. Antioxidant activity in culture supernatants and lysates of HepG2 cells at 12 and 48 h were measured. 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining was applied to observe cell morphology in different groups by fluorescence microscopy. Results: Total antioxidant capacity (T-AOC), and glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) activities in the culture supernatant, as well as superoxide dismutase (SOD) activity in the cell lysate at 12 h in the treatment group significantly increased by 80%, 30%, 124% and 22%, respectively when compared with their counterparts in the model group (P ＜ 0.05). At 24 h, the activities of T-AOC, SOD, GSH-Px, CAT and peroxidase (POD) were significantly increased (P ＜ 0.05), and the content of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in the culture supernatant in the treatment group significantly decreased by 29% and 63% (P ＜0.05); a significant decrease of 20% in SOD activity in the cell lysate was observed for the treatment group compared with the model group (P ＜ 0.05). Moreover, the number of damaged cells was reduced in the treatment group than that in the model group, and most cells in the former group had normal morphology. Conclusion: The addition of Lactobacillus casei could increase antioxidant function of HepG2 cells under oxidative stress.

Lactobacillus casei; HepG2 cells; antioxidant; oxidative stress; cell lysates

10.7506/spkx1002-6630-201711035

中圖分類號：TS201.3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-6630（2017）11-0220-05引文格式：

2016-05-12

陜西省農業科技創新與攻關項目（2015NY025）；陜西廣播電視大學重點課題（15D-08-A02）

陳佩（1983—），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：angelchen186@163.com