地高辛標記對旱稻進行southern雜交分析主要影響因素的優化和驗證

邢文岳++蘇樂樂++李朝煒++魏景芳++朱昀

摘要：以轉基因旱稻和野生型旱稻為材料，對通過地高辛隨機引物標記法進行的旱稻基因組Southern雜交條件進行了優化分析，包括探針制備效率、DNA樣品量、酶切體系及轉膜時間等。結果表明：影響探針制備效率的首要因素是溫度而不是時間；DNA上樣量在10～30 μg均可以獲得高質量的雜交圖；60 μL體系15 h即可酶切徹底并獲得良好的雜交效果；轉膜時間6 h即可。本研究所優化的地高辛標記的旱稻雜交分析結果穩定重復性好，具有較高的靈敏度和信噪比。

關鍵詞：旱稻；地高辛；Southern雜交方法；優化；驗證

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0041-03

Southern blotting 技術于1975年由英國科學家Southern創立，隨著該技術的不斷發展與普及，目前已成為分析基因結構和檢測特定DNA片段的經典技術方法之一[1]。該技術能夠在DNA水平檢測外源目的基因是否已經轉入并成功整合到植物的染色體上，同時對外源片段的拷貝數目進行分析。目前，Southern雜交中標記探針的方法有同位素和非同位素2種。使用同位素標記是最經典的方法，其靈敏度高，能檢測出極其微量的信號源，但對試驗的條件有比較嚴格的要求，且會對環境以及實驗者的身體造成放射性輻射危害。非同位素標記又分為生物素標記和地高辛標記。由于生物體中并沒有地高辛，所以相比于生物素而言，地高辛可以更好地消除內源性背景，應用前景也更為廣闊[2]。據報道，棉花[3]、煙草[4]、小麥[5]、油菜[6]、甘蔗[7]、橡膠樹[8]、熱帶果樹[9]等植物用地高辛標記的雜交技術均可獲得良好的雜交效果。

目前，雖然有地高辛標記探針試劑盒大大方便了試驗，但是試劑盒說明書更多地側重于步驟流程的描述，至于一些技術要點、操作細節、實驗注意事項的介紹并不很多。這也直接導致許多試驗沒能得到滿意的結果。本研究以8個不同的LEA家族抗逆旱稻品種為材料，參考前人成功經驗，結合本實驗室的實際情況，對地高辛標記探針的Southern雜交方法進行探索改進和優化，取得了理想效果，現作一總結。

1材料與方法

1.1試驗材料

轉基因的T3代旱稻由本實驗室通過農桿菌侵染法獲得。

1.2試驗方法

1.2.1探針標記反應管中加1 μg純化的目的基因DNA片段，加ddH2O至終體積16 μL。沸水浴10 min變性，迅速插入冰水混合物中，取混勻的地高辛高效引物4 μL到變性的DNA中，混勻，37 ℃孵育20 h。加入2 μL 0.2 mol/L EDTA（pH值8.0）或65 ℃加熱10 min終止反應。

1.2.2旱稻基因組DNA的提取及純化采用改良的CTAB[10]法對旱稻基因組進行提取，略加改動。65 ℃預熱 15 mL 提取緩沖液[CTAB 30 mg/mL，NaCl 1.4 mol/L，EDTA（pH值8.0）20 mmol/L，Tris-HCl（pH值8.0）100 mmol/L，β-巰基乙醇0.2%（V/V）]；液氮研磨2.5 g植物葉片成粉末后刮入離心管的提取緩沖液中，65 ℃保溫40～60 min，每 10 min 輕取出輕搖混勻；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，靜置15 min，12 000 r/min離心15 min；轉移上清至一新的Eppendorf管，加等體積的氯仿/異戊醇，混勻10 min，靜置10 min，12 000 r/min離心10 min；將上清液轉移到新的離心管中，加1倍體積的異丙醇，混勻；-20 ℃放置1 h或過夜，將絮狀沉淀轉移至一新的離心管中，70%乙醇洗滌，無水乙醇洗滌，吹干溶解；加入適量RNase對樣品進行消化，之后分別用酚/氯仿/異戊醇以及氯仿/異戊醇抽提1次，乙醇洗滌沉淀，超凈臺上吹干，溶于適量TE。用分光光度計測定樣品DNA濃度以及D260 nm/D280 nm比值。

1.2.3樣品酶切60 μL酶切體系中含30 μg純化的旱稻DNA，250U限制性內切酶（Thermo），6 μL 10×buffer，補ddH2O至終體積60 μL。酶切15 h后取2 μL電泳，觀察旱稻基因組是否酶切徹底。

1.2.4轉膜及固定酶切充分的DNA加loading buffer混勻，80 V電泳約4 h，直至溴酚藍位于凝膠的2/3處。電泳結束后凝膠不做脫嘌呤處理，經NaOH堿變性后參照分子克隆采用毛細管虹吸印跡法轉膜，注意為了分清膜的正反面，要在尼龍膜的一角提前做好標記。將轉膜之后的瓊脂糖凝膠進行檢測，若無核酸殘留，證明轉膜成功。將尼龍膜80 ℃烘烤2 h進行核酸的固定。

1.2.5雜交洗滌將探針沸水浴5 min進行變性，之后快速放入冰水混合物中冷卻，按照25 ng/mL雜交液的量將變性探針加入預熱的雜交液中。預雜交30 min后將預雜交液更換成帶有探針的雜交緩沖液，45 ℃雜交16 h。2×SSC、0.1% SDS室溫洗膜5 min，之后0.5×SSC、0.1% SDS 68 ℃洗膜 15 min。

1.2.6免疫檢測將洗滌過的雜交膜用洗滌緩沖液沖洗 5 min，封阻液孵育30 min，抗體溶液孵育30 min，接著用洗滌緩沖液漂洗2次，每次15 min，檢測緩沖液中平衡5 min，避光條件在顯色液中靜置顯色20 min。染色完成后ddH2O沖洗雜交膜5 min，晾干拍照即可。

2結果與分析

2.1轉膜DNA樣品量對雜交結果的影響

為了獲得較強的雜交信號，分別以10、30、60 μg的DNA量進行雜交。結果顯示，DNA上樣量并非越多越好，高質量的DNA樣品在10 μg的時候也能夠得到很好的雜交信號，30 μg 的上樣量同樣可以洗脫干凈，而樣品量過大形成的較深背景難以在洗脫階段處理干凈（圖1）。

2.2酶切體系對雜交結果的影響

選擇目標基因內不存在的3個常用限制性酶EcoRⅠ、XbaⅡ、SacⅠ消化轉基因旱稻植株的基因組。30 μg的DNA量在60 μL酶切體系中需15 h才可獲得好的酶切結果，時間較短會導致酶切不充分（圖2），影響雜交結果，甚至出現非特異性雜交條帶。酶切后如果進一步純化，會造成DNA量的損耗，而前期獲得的純度高、質量好的DNA酶切消化后可以直接轉膜用于后續雜交試驗。

2.3探針標記效率的影響因素

探針標記效率對雜交有著重要的影響。而標記效率就試劑盒說明書描述和時間相關度并不很大，以3 000 ng模板DNA為例，標記1 h可獲得1 350 ng探針，而當標記時間延長到20 h后獲得的探針也只有2 650 ng，因此時間并不是探針標記效率的主要影響因素。本試驗發現，標記初期的溫度對標記效率有絕對的影響。剛剛進行標記的反應體系要嚴格遵守標記溫度，標記初期的溫度不準確會導致最終的標記效率大幅度降低。如圖3所示，A圖為嚴格遵守孵育溫度37 ℃的

探針標記效率檢測：第1排為對照樣品，濃度從左到右依次為1 ng、10 pg、3.3 pg、1 pg、0.3 pg、0.1 pg；第2排為試驗樣品，從左到右依次進行梯度稀釋，第3排為試驗樣品的重復，稀釋濃度同第2排相應位置的點。B圖為標記初期溫度略低的探針標記效率檢測（32 ℃進行）：第1排為對照樣品，濃度從左到右依次為1 ng、10 pg、3.3 pg、1 pg、0.3 pg、0.1 pg；第2排為試驗樣品，依次進行梯度稀釋，第3排為試驗樣品的重復，稀釋濃度同第2排相應位置的點。A、B 2張圖中試驗樣品的稀釋梯度完全相同。由圖3還可見，A圖中8號點的量與4號點的量相等，均為0.1 pg；B圖中6號點的量與B圖中4號點的量相等，均為0.1 pg，而A圖點8和B圖點6的稀釋倍數相差100倍。由此可見溫度對標記效率的影響極大，探針標記初期5 ℃的浮動導致2次探針標記效率相差有100倍之多。標記后的探針不需要純化即可用于后續試驗。

2.4轉膜時間的控制

以往的試驗為了保證充分轉膜都是采用過夜轉膜，但過夜轉膜耗時較長，延長了整個試驗的時間，影響了試驗進度。在轉膜時分別對2、4、6、8 h的轉膜情況進行了觀察，發現轉膜時間在6 h的時候，瓊脂糖凝膠上面已經看不到DNA片段（圖4），表明轉膜已經完全，大大縮短了整個試驗的時間。

2.5雜交溫度的選擇

適宜的雜交溫度是根據GC含量和探針與靶片段的相似百分數計算獲得的，具體公式如下：Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I），I=能夠雜交上的片段的長度，以堿基對進行計算。Topt.=Tm-（20～25 ℃）。本試驗%G+C=53.7，I=806，Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）=71.1。計算結果Topt.=46.1～51.1 ℃。由于說明書建議雜交在37～42 ℃

進行，因此我們在37、42、45 ℃均進行了雜交，差別不大。最終雜交選擇在45 ℃進行。

2.6顯色液對結果的影響

地高辛雜交試劑盒里面的顯色液（5號管）平時貯藏在 -20 ℃ 的冰箱中，一般情況下底部會出現棕褐色顆粒狀沉淀，配制顯色液時要事先吹吸數次混勻。需要注意的是沉淀懸浮起來后不要立即使用，一定要使顆粒完全溶解，在溶液中看不到有顆粒狀物質，溶液均勻清澈為止。否則雜交膜的背景顏色較深，且呈現顆粒狀（圖5），嚴重影響結果的觀察。

3討論

陽性對照是雜交體系中的重要組成部分。以質粒為模板進行PCR擴增的產物作為陽性對照。轉膜時的電泳上樣量并非越多越好，樣品量過大容易出現非特異條帶，試驗顯示不超過50 ng的純化后的PCR產物可以獲得良好的雜交效果。

尼龍膜在雜交中應盡量與雜交管貼合，不要有氣泡出現，否則會嚴重影響雜交結果。一般趕走氣泡的工具采用玻璃棒，將膜小心放入有雜交液的雜交管中后用玻璃棒仔細趕走雜交膜與雜交管之間的氣泡。由于雜交液中成分的影響，雜交膜與雜交管之間經常出現大量的微小氣泡，很難徹底驅趕干凈，并在此操作過程中對雜交膜和轉移的DNA樣本造成傷害，嚴重影響雜交結果（圖6）。本試驗采用寬底試管去擠壓膜與管之間的氣泡，由于試管底面積寬，不易對膜造成損傷，可以獲得良好的雜交效果。

雜交中，足夠的探針用量是保證雜交成功的必要條件。但是，過量的探針會導致背景顏色過重，難以洗滌干凈。說明書中建議探針使用量為25 ng/mL雜交液，為了獲得更清晰的

雜交結果，筆者做了不同探針用量的雜交。試驗結果顯示，探針濃度提高到50 ng/mL雜交液時對雜交背景影響不大，仍然可以獲得清晰背景的雜交條帶。

以往報道認為，農桿菌侵染法進行的植物轉化，轉入基因多以單拷貝或較低拷貝數插入[11-13]，在本試驗中，進行了8個樣品的Southern雜交分析，僅有2個樣品鑒定為單拷貝，其余6個樣品中最多甚至出現了8個拷貝。這說明對于農桿菌侵染法獲得的轉基因植株后代而言，低拷貝并不是絕對的，可能與愈傷組織的狀態、侵染條件都有一定關系。

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