高效溶磷菌的篩選、鑒定及其溶磷特性

邵鍇++邱業(yè)先++徐婧

摘要：為了從根際土壤中篩選出具有較高溶磷能力的菌株及優(yōu)化溶磷條件，通過種子萌發(fā)初步研究溶磷促生效應(yīng)。通過稀釋涂布法分離、篩選菌株，并進(jìn)行ATB細(xì)菌鑒定儀及16S rDNA測(cè)序鑒定；采用單因子試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株溶磷發(fā)酵條件，利用種子發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定菌株的促生能力。結(jié)果顯示，篩選出菌株BD-1的溶磷能力最強(qiáng)，經(jīng)ATB細(xì)菌鑒定儀及16S rDNA測(cè)序，該菌株被鑒定為路德維希腸桿菌。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、接種量為2 mL、初始pH值為7.0的條件下培養(yǎng)7 d的溶磷效果最好，其溶磷量為181.73 g/L。種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，該溶磷菌對(duì)作物種子萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：溶磷菌；微生物肥料；條件優(yōu)化；解磷能力；種子萌發(fā)；鑒定；篩選；溶磷特性

中圖分類號(hào)： S154.38+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0253-04

磷是植物生長必需的營養(yǎng)元素之一，植物的光合作用和體內(nèi)的生化過程都必需有磷參與[1-2]，但其在土壤中主要以難溶性礦物態(tài)存在[3]，難溶性礦物態(tài)磷無法被作物直接吸收利用。為提高作物產(chǎn)量，超過90 kg/hm2磷肥被施用于土壤中[4]，部分磷肥被作物吸收利用，大部分被轉(zhuǎn)化成難溶性磷返施于土壤。大量化學(xué)磷肥的施用，伴隨土壤板結(jié)、土壤酸化、土壤貧瘠化日益嚴(yán)重。因此，提高土壤中磷的利用效率對(duì)降低化學(xué)磷肥的施用量具有十分重要的意義。土壤中存在大量的微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用形態(tài)，具有這種能力的微生物稱為解磷菌或溶磷菌[5]。溶磷微生物作為微生物肥料的開發(fā)和利用已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。土壤中存在的溶磷微生物能夠通過自身生長代謝，轉(zhuǎn)化難溶性磷為可溶性磷，促使作物吸收利用。但是，微生物僅能夠溶解難溶性磷，還不能被認(rèn)為就是溶磷菌，溶磷菌還須考慮作物促生效應(yīng)[6]。目前，有關(guān)農(nóng)作物溶磷微生物的分離和應(yīng)用也有一定的研究。李倩利用蒙金娜無機(jī)溶磷培養(yǎng)基從桂花樹根際黏附土壤中分離篩選出1株高效溶磷菌株，為洋蔥伯克霍爾德氏菌，并測(cè)得其溶磷量為 503.53 μg/mL[7]。劉文干等從花生根際土壤樣品中篩選到1株溶磷能力強(qiáng)的菌株黑曲霉，溶磷量達(dá)到177.4 mg/L[8]。因此，合理利用溶磷微生物與開發(fā)微生物肥料對(duì)提高作物產(chǎn)量、減少化學(xué)肥料使用、降低環(huán)境土壤污染具有巨大前景[9-10]。大多數(shù)學(xué)者從單一磷源中篩選溶磷菌，而進(jìn)行多種磷源篩選溶磷菌、提高溶磷菌的質(zhì)量與特性就尤為重要。本研究以采自作物的根際土壤為研究對(duì)象，分離、篩選出溶磷細(xì)菌，通過ATB細(xì)菌鑒定儀及16S rDNA測(cè)序鑒定出溶磷細(xì)菌，研究高效溶磷菌的溶磷效果，運(yùn)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)[11-12]對(duì)溶磷菌的溶磷效果進(jìn)行優(yōu)化，并通過種子萌發(fā)進(jìn)行溶磷促生初步效果驗(yàn)證，為溶磷菌菌劑開發(fā)微生物肥料打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤來源于2015年4月15日采集江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)雙溝陳甸果園里長勢(shì)良好的扁豆、韭菜、紅薯、毛豆等作物的根際土壤。土樣采集后放置于無菌袋中，于實(shí)驗(yàn)室 4 ℃ 冰箱內(nèi)保存。

1.1.2培養(yǎng)基有機(jī)磷篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、CaCO3 5 g、（NH4）2SO4 0.5 g、MgSO4 0.3 g、FeSO4 0.3 g、KCl 0.3 g、NaCl 0.3 g、卵磷脂0.2 g、MnSO4 0.03 g，無菌水1 000 mL，pH值 7.0～7.2；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，無菌水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1溶磷細(xì)菌的篩選

1.2.1.1溶磷細(xì)菌的分離稱取5 g土樣加入45 mL無菌水，于28 ℃、180 r/min下振蕩0.5 h，充分混勻，制成10-1濃度梯度，按10倍稀釋法制備成10-3、10-4、10-5、10-6 各梯度土樣懸液，各梯度吸取100 μL土樣懸液均勻涂布在有機(jī)磷培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)3組重復(fù)。倒置平板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，用無菌的牙簽挑取菌落，并通過劃線分離純化得到單菌落，保存于LB斜面培養(yǎng)基中，4 ℃冰箱保存。

1.2.1.2溶磷細(xì)菌的篩選（1）將斜面保存的菌種用無菌牙簽挑取出來轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基上，倒置平板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落的直徑（d）和透明圈的直徑（D），用D/d表征溶磷菌的溶磷能力以作為初篩。（2）將初篩得到的菌種用無菌生理鹽水制備成相應(yīng)濃度菌懸液，于150 r/min、28 ℃下培養(yǎng)5 d，以接無菌水的搖瓶作對(duì)照。培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無菌的50 mL離心管中，采用超聲波破碎，處理時(shí)間為20 min，使之釋放出細(xì)胞內(nèi)的有效磷。以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心20 min，留上清液待測(cè)，參考張祥勝的鉬銻抗比色法測(cè)上清中有效磷含量[13]。

1.2.1.3溶磷細(xì)菌對(duì)不同磷源的溶磷效果將有機(jī)磷的磷源依次替換成等量的磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸鋁，通過上述鉬銻抗比色法測(cè)量溶磷細(xì)菌對(duì)不同磷源的溶磷效果。

1.2.2溶磷細(xì)菌的鑒定

1.2.2.1ATB細(xì)菌的鑒定參照ATB細(xì)菌鑒定手冊(cè)對(duì)溶磷細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.2.2.216S rDNA測(cè)序分離得到的溶磷細(xì)菌BD-1用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR所用引物為：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μL、DNA template 1 μL、Primer F 2 μL、Primer R 2 μL、Nuclease-free ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán) 30次；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用試劑盒純化，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過CLUSTAL X進(jìn)行多重序列比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果轉(zhuǎn)換為MEGA格式，輸入到MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹探討目的菌株的親緣性。

1.2.3溶磷菌溶磷條件優(yōu)化采用正交設(shè)計(jì)對(duì)溶磷效果進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)溶磷細(xì)菌溶磷效果響應(yīng)時(shí)間變化，主要考慮溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、初始pH值對(duì)溶磷效果的影響，采用4因素3水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，3組重復(fù)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.2.4種子發(fā)芽指標(biāo)的測(cè)定根據(jù)優(yōu)化結(jié)果培養(yǎng)溶磷菌制備菌懸液，挑選顆粒飽滿的白菜蘇州青種子，先用70%乙醇消毒，再用0.1% HgCl2浸泡1 min，無菌水清洗3次，放入預(yù)先滅菌好的培養(yǎng)皿中，每皿50粒，無菌注入稀釋10倍的上述菌懸液10 mL，無菌水處理為對(duì)照（CK），于25 ℃恒溫培養(yǎng) 7 d。根據(jù)發(fā)芽試驗(yàn)期間的記錄，計(jì)算各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)：發(fā)芽勢(shì)（GE）=前3 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽率（GP）=7 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)（GI）=Gt/Dt（Gt指在t d內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間）；活力指數(shù)（VI）=Gt/Dt×幼苗生長勢(shì)；幼苗生長勢(shì)=預(yù)選時(shí)間內(nèi)供試種子平均芽長+平均根長（芽長為發(fā)芽7 d量取的幼苗芽長；根長為發(fā)芽7 d量取的幼苗根長）。

2結(jié)果與分析

2.1溶磷細(xì)菌的篩選

本研究篩選到有透明圈的菌株為43株，發(fā)現(xiàn)透明圈D/d的值與搖瓶復(fù)篩并不成線性比列，與許多學(xué)者研究結(jié)果一樣，所以以搖瓶復(fù)篩選取10株D值較大菌株結(jié)合不同磷源的液體搖瓶復(fù)篩，結(jié)果見表2，其中MD-8在初始卵磷脂搖瓶篩選中溶磷量最大，對(duì)其他3種磷源溶解效果不是很明顯，而BD-1在不同磷源下的水溶性磷都比較大，所以BD-1被選作進(jìn)一步研究的菌株。

2.2溶磷細(xì)菌的鑒定

2.2.1ATB細(xì)菌鑒定結(jié)果ATB細(xì)菌鑒定儀測(cè)定的生化反應(yīng)譜如表3所示，鑒定結(jié)果為腸桿菌屬菌株。

2.2.216S rDNA測(cè)序結(jié)果根據(jù)16S rDNA測(cè)序與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì)的結(jié)果，對(duì)溶磷菌BD-1與參比菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖1可看出，BD-1與菌株路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）處于同一分支，親緣關(guān)系較近，且同源性高達(dá)99%，NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為NR 042349.1，所以菌株

暫鑒定為路德維希腸桿菌。

2.3培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

從圖2可以看出，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)培養(yǎng)基中水溶性磷影響較大，在pH值為7～8的條件下溶磷效果較好；在搖床轉(zhuǎn)速120～160 r/min下，培養(yǎng)基中溶磷量較高，并在 150 r/min 下達(dá)到最佳溶磷效果；隨著溫度升高，培養(yǎng)基中溶磷量先增后減，在30 ℃下溶磷效果最好，所以確定最佳溫度為30 ℃；隨著接種量的增加，培養(yǎng)基中溶磷量也是先增后減，在2.0～2.5 mL下達(dá)到穩(wěn)定。

由圖3 可以看出，溶磷菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)基中溶磷量先緩慢增加，在培養(yǎng)后7 d達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這主要是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)逐步減少，同時(shí)微生物代謝副產(chǎn)物出現(xiàn)累積，導(dǎo)致微生物活性下降，從而使培養(yǎng)基中溶磷量下降。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d。

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果

為了優(yōu)化溶磷菌的培養(yǎng)條件，根據(jù)以上單因素試驗(yàn)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，所得結(jié)果見表3。綜合正交試驗(yàn)的k值和極差R大小，影響供試菌BD-1溶磷量的主次順序?yàn)锳>B>C>D，即溫度>轉(zhuǎn)速>接種量>初始pH值，且最優(yōu)水平為A2B3C2D2，即溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量2 mL、初始pH值7.0。針對(duì)該條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間為7 d，溶磷量為 181.73 mg/L。證明通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，調(diào)整后的培養(yǎng)條件有利于供試菌BD-1的溶磷效果。

2.5種子發(fā)芽結(jié)果

從表4、圖4可以看出，BD-1溶磷菌具有一定的促生效

應(yīng)。溶磷菌液能分別提高發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)4百分點(diǎn)、8百分點(diǎn)、5.35，促進(jìn)種子萌發(fā)周期，提高作物種子利用效率，說明溶磷菌液對(duì)作物根系有促生作用。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從作物根際土壤中成功分離篩選到1株耐受不同

磷源的廣譜性磷細(xì)菌，通過ATB細(xì)菌鑒定儀及16S rDNA測(cè)序初步鑒定為路德維希腸桿菌。路德維希腸桿菌溶磷效果少有報(bào)道，龔鳳娟等從杜仲中分離到路德維希腸桿菌，發(fā)現(xiàn)它具有1-羧基-1-氨基環(huán)丙烷（1-aminocy-clop ropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶活性[14]；王西祥等分離得到的路德維希腸桿菌產(chǎn)吲哚乙酸量達(dá)148.80 mg/L[15]；王金昌等成功分離篩選到的路德維希腸桿菌既能解鉀又能解磷，還能促進(jìn)蕹菜的生長[16]；Shoebitz等從多年生黑麥草根際篩選到路德維希腸桿菌，并從固氮酶活性、溶磷特性、IAA分泌以及相關(guān)促生長試驗(yàn)中證實(shí)此菌株具有PGRP特性[17]；Walpola篩選出抗殺菌劑的路德維希腸桿菌，并且具有一定的溶磷效果，為生物接種劑提供理論指導(dǎo)[18]；王舒等分離得到的路德維希腸桿菌在NBRIP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d的有效磷含量達(dá) 401.56 mg/L[19]。本研究分離得到的菌株BD-1解磷能力稍弱，但本研究以不同磷源作篩選培養(yǎng)基篩選到的菌株具有溶解多種難溶性磷酸鹽的作用，進(jìn)而能提高溶磷菌株的溶磷寬度。

有關(guān)細(xì)菌溶磷條件的優(yōu)化早有研究，多數(shù)從碳源、氮源、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量等方面進(jìn)行研究[20-21]。本研究通過初始pH值、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速這4個(gè)因素進(jìn)行路德維希腸桿菌BD-1溶磷條件的正交優(yōu)化，并根據(jù)溶磷效果相應(yīng)時(shí)間的變化，證明在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量 2 mL、初始pH值7.0的條件下發(fā)酵7 d時(shí)，發(fā)酵液中的溶磷量最高，達(dá)到181.73 mg/L ，然而這種溶磷優(yōu)化條件還只是試驗(yàn)性的，要真正應(yīng)用到微生物肥料工業(yè)化生產(chǎn)中還須要進(jìn)一步生產(chǎn)工藝研究。

該試驗(yàn)從種子萌發(fā)對(duì)溶磷菌促生效應(yīng)進(jìn)行初步研究，通過種子萌發(fā)試驗(yàn)證明BD-1溶磷菌在發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等方面對(duì)作物有一定的促生效應(yīng)，較對(duì)照組分別提高5.56%、10.26%、7.54%、13.22%，具有一定的研發(fā)價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]麻瑞陽. 高效解磷解鉀菌株NX-11的分離篩選鑒定及作用效果分析[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[2]Oliveira C A，Alves V M，Marriel I E，et al. Phosphate solublilizing microorganisms isolated from rhizosphere of maize cultivated in an oxisol of the Brazilian Cerrado Biome[J]. Soil Biology & Biochemistry，2008，41（9）：1782-1787.

[3]朱培淼，楊興明，徐陽春，等. 高效解磷細(xì)菌的篩選及其對(duì)玉米苗期生長的促進(jìn)作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（1）：107-112.

[4]Li T L，Xie Y H，Hong J P，et al. Effects of phosphorus application rates on winter wheat yield and phosphorus use efficiency in drylands of South Shanxi Province[J]. Eco-Agri，2013，21（6）：658-665.

[5]趙小蓉，林啟美. 微生物解磷的研究進(jìn)展[J]. 土壤肥料，2001，1（3）：7-11.

[6]Walpola B C，Yoon M H. Phosphate solubilizing bacteria：assessment of their effect on growth promotion and phosphorous uptake of mung bean[Vigna radiate （L.） R. Wilczek][J]. Chilean Journal of Agricultural Research，2013，73（3）：275-281.

[7]李倩. 高效溶磷菌的篩選、溶磷特性及菌群協(xié)同作用的研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2015.

[8]劉文干，曹慧，樊建波，等. 一株紅壤花生根際溶磷真菌的分離、鑒定及溶磷能力的研究[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2012，49（5）：988-995.

[9]Chen Y P，Rekha P D，Arun A B，et al. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities[J]. Applied Soil Ecology，2006，34（1）：33-41.

[10]張毅民，孫亞凱，呂學(xué)斌，等. 高效溶磷菌株Bmp5篩選及活力和培養(yǎng)條件的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（3）：61-65.

[11]劉瑩瑩，李冠杰，劉莉，等. 地衣芽孢桿菌DY-1溶磷條件的研究[J]. 河南科學(xué)，2015，7（7）：1114-1118.

[12]付學(xué)琴，龍中兒，魏賽金，等. 硅酸鹽細(xì)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（7）：121-123，126.

[13]張祥勝. 鉬銻抗比色法測(cè)定磷細(xì)菌發(fā)酵液中有效磷含量測(cè)定值的影響因素分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（12）：4822-4823.

[14]龔鳳娟，恩特馬克·布拉提白，張宇鳳，等. 具有ACC脫氨酶活性的杜仲內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及其抗菌活性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（10）：1526-1532.

[15]王西祥，徐坤，張冬梅，等. 5株生姜促生菌的初步鑒定及產(chǎn) IAA和抑菌能力測(cè)定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（1）：36-40，46.

[16]王金昌，鄭國華，傅筱沖. 一株解鉀解磷菌株的篩選[J]. 江西科學(xué)，2014，32（1）：51-53，103.

[17]Shoebitz M，Ribaudo C M，Pardo M A，et al. Plant growth promoting properties of a strain of Enterobacter ludwigii isolated from Lolium perenne rhizosphere[J]. Soil Biology & Biochemistry，2009，41（9）：1768-1774.

[18]Walpola B C. Effect of fungicides on phosphate solubilization by klebsiella oxytoca and Enterobacter ludwigii[J]. Korean Journal of Soil Science and Fertilizer，2013，46（2）：112-116.

[19]王舒，張林平，張揚(yáng)，等. 紅壤區(qū)油茶根際解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及其解磷能力[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2015，28（3）：409-416.

[20]黃達(dá)明，李倩，管國強(qiáng)，等. 一株解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及其溶磷培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（2）：173-178.

[21]劉云華，吳毅歆，楊紹聰，等. 洋蔥伯克霍爾德溶磷菌的篩選和溶磷培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（3）：78-82.