水產品中硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測技術的研究進展

楊惠宇+張惠峰

摘 要：綜述了水產品中硝基呋喃類藥物代謝規律，分別介紹了硝基呋喃原藥及其代謝物的檢測方法，比較了各種方法在實際應用中的優缺點，并對檢測方法進行了展望，以期為水產品中硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測的研究提供幫助。

關鍵詞：硝基呋喃類；代謝物；水產品；檢測方法

硝基呋喃類藥物作為一種抗菌藥物曾被廣泛的應用于水產養殖中，現國內外對硝基呋喃類藥物的控制都十分嚴格[1-2]，我國該類藥物的檢測標準也有明確的規定[3-5]。硝基呋喃類藥物雖然被禁止，但其在治療水產養殖動物細菌性尤其是胃腸道等細菌性疾病方面快速有效，仍有漁民使用。硝基呋喃類藥物是檢出率最高的違禁藥物之一[6-8]，正嚴重威脅著人的健康安全，因此開展水產品中硝基呋喃藥物及其代謝物的檢測工作十分必要。

1 硝基呋喃類藥物及其代謝物的基本性質及危害

硝基呋喃類藥物是一種合成的重要的抗感染性藥物，常用的有呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃妥因（Nitrofurantion）、呋喃它酮（Furaltadone）、呋喃西林（Furacillin）。其對應的代謝物分別為3-氨基-2-惡唑烷基酮（AOZ）、1-氨基-2-內酰脲（AHD）、5-甲基-嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）。硝基呋喃類藥物是一種具有潛在致癌和誘導機體產生突變的物質[9-10]，對人類身體健康構成嚴重威脅[11]。四種硝基呋喃原藥、代謝物分子結構圖如下：

2 水產品中硝基呋喃類藥物代謝規律

硝基呋喃類藥物在水產品中的代謝和殘留規律研究，主要有呋喃唑酮和呋喃西林[12]。通常情況下，硝基呋喃類在養殖動物體內的代謝速度非?？?，3 d內就檢測不到原藥。其中，呋喃唑酮的研究以口服和口灌藥餌的方式為主，呋喃西林的研究以藥浴的方式為主。國內對呋喃唑酮的代謝和殘留規律研究主要涉及草魚、羅非魚、牙鲆、鯉、雜交鱧、斑點叉尾鮰、異育銀鯽、團頭魴、鰻鱺和大菱鲆等。徐維海等[13]研究表明，給羅非魚肌肉中注射呋喃唑酮原藥，在停藥24 h后原藥檢測值低于檢測限（10 μg/kg），而肌肉中呋喃唑酮的代謝物在22 d后才低于檢測限（1 μg/kg）。呋喃西林在養殖魚體內的殘留研究，國內僅有雜交鱧、大菱鲆和斑點叉尾鮰的報道。劉書貴等[14]給雜交鱧魚苗藥浴量為2 mg/L的呋喃西林2 d，50 d后呋喃西林代謝物SEM在肌肉組織中的殘留為0.75 μg/kg。海參中硝基呋喃類相關代謝殘留研究較少。雖然硝基呋喃類藥物在海參中檢出比重較大、檢出含量較高[15-16]，但因其養殖周期較長，僅邢麗紅等[17]研究了呋喃西林在海參中的代謝殘留規律。甲殼類動物體內的硝基呋喃類藥物殘留規律代謝研究較少，于慧娟[18]等通過研究發現動物源性食品中氨基脲的殘留通常是由于在動物養殖過程中使用了呋喃西林后代謝產生的，但不是氨基脲的唯一來源，該類研究打破了硝基呋喃類代謝物殘留由于在養殖過程中非法使用造成的通常認知。以上研究表明，呋喃類原藥在水產品體內可以很快消解而其代謝物可在水產品體內殘留很長時間，因而目前的檢測方法研究主要集中于硝基呋喃代謝物殘留量的檢測。

3 硝基呋喃原藥及其代謝物殘留檢測技術

硝基呋喃的殘留檢測一般可分為原藥和其代謝物的檢測，早期的檢測主要針對原藥且研究相對較少，而其代謝物檢測方法研究相對較多。

3.1 硝基呋喃代謝物檢測

硝基呋喃類代謝物極性相對較強，因其結構易與色譜柱硅膠表面重金屬螯合及紫外光譜吸收不明顯、相對分子質量小、離子化效率低等特點[19]，常需進行衍生化后檢測。此外，水產品樣品基質中蛋白質、脂肪等干擾物質較多，影響最終的定性定量。因此，硝基呋喃類代謝物一般經衍生化后，采用液液萃取、固相萃取、凝膠滲透色譜、免疫親和色譜、超臨界流體萃取、分子印跡、平行蒸發等方法[20-22]提取凈化后，用液相色譜法或質譜聯用法進行檢測。此外，還有免疫分析法和光譜分析法等一些新興方法用于硝基呋喃類代謝物的檢測。

3.1.1 色譜分析法

在硝基呋喃類抗生素的檢測過程中高效液相色譜法（HPLC）是比較常見的，高效液相色譜法所使用的檢測器一般為紫外檢測器（UV，包括二極管陣列檢測器DAD）以及各種色譜聯用技術，包括質譜聯用技術。

3.1.1.1 液相色譜-紫外檢測器（LC-UV）

在硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測中應用較多的是高效液相色譜，王媛等[23]利用紫外檢測器（UV），通過固相萃取的前處理技術檢測水產品中硝基呋喃類及其代謝物。該方法具有技術簡單、快速、成本低和重復性好等優點，但由于呋喃類結構的紫外光譜吸收不夠明顯，因此高效液相色譜結合紫外檢測器檢測呋喃類藥物代謝物時靈敏度不高，該方法檢測呋喃類藥物代謝物時具有一定局限性。

3.1.1.2 液相色譜熒光檢測器（LC-FLD）

液相色譜熒光檢測器（LC-FLD）法采用柱前水解衍生化同時進行，使四種硝基呋喃類代謝物同熒光衍生化試劑反應從而增強了熒光強度，提高了檢測的靈敏度。陳明明[24]利用該法檢測蝦肉中硝基呋喃類抗生素，加標回收率為87.4～107%，相對標準偏差為3.7～8.5%，檢測方法的各項性能指標均得到了顯著改善。

3.1.1.3 超高效液相色譜發（UPLC）

超高效液相色譜法與傳統的液相色譜HPLC相比，全面提升了分離的效率、峰容量和靈敏度，在多殘留檢測方面有獨特的優勢。羅文婷等[25]利用超高效液相色譜法（UPLC）檢測水產品中硝基呋喃類藥物，線性相關系數為r=0.999 7，精密度和靈敏度均滿足檢測要求。

3.1.2 質譜聯用分析法

3.1.2.1 液相色譜-質譜（LC-MS）

高效液相與質譜聯用，通過色譜對多組分的混合物來進行分離，對復雜混合物中的組分進行定量和定性分析具有重要意義。Hormazabal等人[26]利用LC-MS法同時測定肉類中四種硝基呋喃類藥物及其代謝物，檢測限達到0.2～0.5 ng/g。但是，目前歐盟認為，HPLC-MS只能用于硝基呋喃代謝物的篩選試驗，對于檢測過程中的陽性結果還需使用LC-MS/MS進一步確認。

3.1.2.2 液相色譜-串聯質譜（包括UPLC-MS/MS和LC-MS/MS）

近年來，高效液相色譜-串聯質譜技術和超高效液相-串聯色譜技術被廣泛應用于檢測各種復雜基質中硝基呋喃類藥物及其代謝物，該檢測方法具有定性定量準確、檢測限低、檢測速度快等特點，我國已將液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）作為測定水產品中硝基呋喃類代謝物的標準測定方法[27]。萬建春等[28]和王艷榮[29]分別利用LC-MS/MS和UPLC-MS/MS檢測水產品中硝基呋喃代謝物殘留量，該方法檢測硝基呋喃代謝物的回收率和方法精密度都較好。以上所使用儀器為液相色譜-三重四級桿聯用質譜法，也有文獻報道使用液相色譜-質譜復合掃描[30]技術，該方法既可檢測硝基呋喃類原藥也可檢測其代謝物，此類方法也能夠檢測出水產品中硝基呋喃類代謝物的殘留量，具有一定應用前景。由于高效液相色譜-串聯質譜法既快速靈敏度又高，為檢測水產品中硝基呋喃類代謝物提供了穩定的技術。

3.1.3 快速檢測法

因硝基呋喃類代謝物殘留檢測周期長、成本高，具有一定的局限性?，F場快速篩查檢測方法可進行批量檢測，能夠達到初步檢測的效果，可有效地促進水產品行業的監管。但是該方法準確度不高，容易出現假陽性。

3.1.3.1 酶聯免疫吸附分析技術（ELISA）

酶聯免疫吸附分析技術將抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機結合，可進行定性和定量以及現場的快速檢測。該方法檢測時間短，結果準確，適用于大批量水產品樣品的篩選，現基于ELISA技術的硝基呋喃代謝物檢測試劑盒已廣泛應用于現場檢測領域[31-32]。

3.1.3.2 免疫膠體金技術（GICT）

劉歡等[33]對水產品中硝基呋喃代謝物的快速檢測方法進行了一系列的質量分析和評估，對市售3種水產品假陽性率、假陰性率、檢出率及穩定性指標進行驗證。結果表明不同批次間產品穩定性存在差異，且有假陽性現象產生，因此快速檢測方法在投入使用之前有必要對其最低檢出限、假陰/陽性率、穩定性等參數進行驗證。

3.1.3.3 化學發光免疫分析法（FI-CL）

化學發光免疫分析法是在酶免疫分析法之后發展起來的一項新型免疫檢測技術，用于各種藥物的檢測分析。謝體波等[34]利用該技術測定水產品中呋喃唑酮代謝物殘留，回收率為82%～94%，變異系數小于10%。

3.1.3.4 熒光免疫法（FIA）

熒光免疫法是用熒光納米顆粒代替傳統膠體金顆粒作為標記物，制備熒光免疫層析試紙條測定水產品中硝基呋喃類藥物及其代謝物的殘留量。張蕾[35]利用熒光免疫法對水產品中蝦肌肉中呋喃唑酮代謝物殘留量進行檢測，該方法的檢測限為10.0 ng/g，假陰性率、假陽性率均小于5%。

3.1.4 光譜分析法

拉曼光譜法（SERS）是一種特征分子振動能級的指紋光譜。余婉松等[36]制備了多種金屬溶膠用作SERS活性基底，成功測定魚肉中呋喃唑酮代謝物，最低檢測濃度達到0.1 mg/L。

3.2 硝基呋喃原藥檢測

硝基呋喃原藥在動物體內非常不穩定并且迅速代謝，因此對于原藥的檢測研究相對較少。

3.2.1 色譜分析法—液相色譜-紫外檢測器（LC-UV）

蔡友瓊等[37]采用高效液相色譜-紫外檢測器測定水產品中硝基呋喃類藥物，該方法因技術簡單、快速、成本低和重復性好等優點，已被上海市食品藥物監督管理局作為水產品中硝基呋喃類藥物監控的檢測方法，在相關實驗室得到了廣泛的應用。

3.2.2 質譜分析法—液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）

徐英江等[38]研究了海產品中4中硝基呋喃類原藥的固相萃取，超高效液相色譜串聯質譜分析方法，該方法檢測呋喃唑酮和呋喃它酮的檢出限為0.15 μg/kg，呋喃西林和呋喃妥因的檢出限為0.3 μg/kg，4種硝基呋喃原藥的平均加標回收率為75%～98%。

3.2.3 光譜分析法—分光光度法

景立新等[39]利用分光光度法快速測定海蝦中的呋喃唑酮殘留量，此方法測定簡單，線性范圍為0.25～20 μg/mL，線性相關系數r=0.998 8，檢出限為2.5 μg/kg，相對標準偏差<4.3%，回收率在97%～102%之間。分光光度法檢測所需儀器設備簡單，操作方便，但該方法檢測的靈敏度不高，容易出現假陽性，不適合定量分析，可作為初級篩查硝基呋喃類代謝物的方法。

3.2.4 快速檢測法—酶聯免疫

蔣宏偉[40]利用酶聯免疫方法對水產品中硝基呋喃原藥進行檢測，該方法能夠達到檢測藥物含量的目的，通過試驗，初步認為酶聯免疫可以作為動物產品中硝基呋喃類藥物含量檢測的篩選方法。

3.2.5 生物芯片技術

生物芯片技術是近年來發展起來的檢測技術，該技術的原理是將生物靶分子與固定化的生物大分子雜交，然后通過特定的儀器檢測雜交信號的變化進行定量，具有檢測快速、高效等特點。吳長虹等[41]用生物芯片技術檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物，檢測限均低于0.5 μg/kg。

4 結論與展望

4.1 總結

硝基呋喃原藥及其代謝物的檢測方法種類繁多，且檢測技術趨于成熟。綜合當前的研究成果，高效液相-質譜聯用技術靈敏度較高?，F將硝基呋喃原藥及其代謝物的檢測方法總結如表1。4.2 展望

本文綜述了多種檢測水產品中硝基呋喃類原藥及其代謝物的方法，如色譜方法、質譜方法、光譜方法、快速檢測方法等，還有一些檢測方法在食品中有一定應用，如原子吸收法[42]、流動注射-化學發光分析技術（FI-CL）[43]、液相色譜電化學檢測器（LC-ECD）[44]，太赫茲時域光譜（THz-TDS）[45]等雖目前并未涉及到水產品領域，但未來具有廣闊的發展前景。

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