葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放、萌發和游動性的影響

楊佳瑤++申紅妙++賈招閃++郭金堂++冉隆賢

摘要：為了研究不同品種及葉齡的葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的影響，選用3個葡萄品種，制備其新葉、老葉的乙醇提取物，測定不同提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放、萌發和游動性的影響。結果表明，不同品種的葡萄葉提取物對霜霉病菌的游動孢子均有明顯的抑制作用，并且新老葉之間差異較小；抗病品種巨峰葉片提取物在濃度為5 mg/mL時對游動孢子釋放、萌發的抑制率都能達90%，并能使游動孢子失去游動性；感病品種紅乳葉片提取物在濃度為10 mg/mL以上時才能達到上述效果；感病品種美人指葉片提取物在濃度為5 mg/mL時對游動孢子萌發的抑制率可達90%，在濃度為10 mg/mL時才對游動孢子的釋放、游動性具有強烈的抑制作用。由結果可知，抗病品種的葡萄葉提取物的抑制效果要好于感病品種，而同一品種的新葉和老葉之間差異基本不顯著。

關鍵詞：葡萄霜霉病；葉提取物；葡萄生單軸霉菌；葡萄；游動孢子；霜霉病防治

中圖分類號： S436.631.1+9 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0079-03

葡萄霜霉病是世界上最嚴重的卵菌病害之一，多發生在雨水較多的地區和年份[1]，在我國各葡萄產區均有分布，其病原為葡萄生單軸霉菌[Plasmopara viticola （Berk. et Curt.） Burl. et de Toni]，屬于藻物界（假菌界）卵菌門卵菌綱霜霉菌目單軸霉屬，是一種專性寄生菌，主要危害葡萄的葉片、新梢、卷須、嫩梢、葉柄、花穗梗等[2]。該菌的無性階段會產生大量孢子囊，在高濕、溫暖的條件下，梨形的孢子囊會釋放多個具有雙鞭毛的游動孢子，當游動孢子靠近氣孔后會收縮其鞭毛變為靜止孢，隨后萌發產生芽管，由氣孔侵入寄主。孢子囊可以通過雨水、空氣等條件傳播后再次進行侵染。在適宜條件下，病菌傳播迅速且危害巨大，每年都會給葡萄產業造成巨大的經濟損失[3-4]。葡萄生單軸霉菌游動孢子的釋放、游動、萌發是病菌完成侵染的關鍵，也是病害發生最重要的階段和病害防治的關鍵時期。Islam等研究發現，2，4-二乙酰基間苯三酚（DAPG）及其衍生物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的釋放和游動性均有良好的抑制作用[5]；Abdalla等研究發現，鏈霉菌ANK313菌株的代謝產物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的游動性具有強烈的抑制作用，同時還表現出對游動孢子具有較強的溶解作用[6]。目前葡萄霜霉病的防治手段以化學農藥為主，雖然化學農藥具有高效、速效和經濟的特點，但是由于大量使用，造成病原產生抗藥性、破壞環境及影響人類健康等諸多弊端[7]。植物源農藥主要來源于植物體內，其有效成分通常不是單一化合物，而是植物有機體中大部分有機物質。與化學農藥相比，植物源農藥具有環境相容性好、對非靶標生物安全、不易產生抗藥性、生物活性多樣、種類多、開發途徑多等優點[8]。近年來，利用植物源提取物防治葡萄霜霉病的研究日漸增多，焦文哲研究表明，樟樹、桉樹、馬齒莧的不同有機溶劑提取物對葡萄霜霉病具有很好的防治作用[9]；郭秀萍等研究發現，葡萄、委陵菜以及無花果葉片的有機提取物能降低葡萄生單軸霉菌的侵染率[10]。

葡萄作為一種具有抗菌活性的生物質資源，具有廣闊的發展前景。葡萄體內包含大量的抗微生物活性的化學成分，如酚酸類、鞣酸類、黃酮類和茋類等[11-12]。Schnee等在葡萄藤提取物中發現，6種物質對葡萄生單軸霉菌具有良好的抑制作用[13]；袁茜等研究認為，葡萄葉有機提取物能明顯抑制黃瓜、辣椒枯萎菌的生長[14]；李曉瓊等研究發現，圓葉葡萄葉提取物對南方根結線蟲具有較強的毒殺活性[15]。關于葡萄不同抗性品種之間存在的抑菌物質的種類和含量是否存在差異，以及是否都能對葡萄生單軸霉菌游動孢子產生抑制作用尚未見報道。為了測定不同抗性葡萄品種，以及不同葉齡葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌的抑制作用，本研究選取對霜霉病具有不同抗性的3個葡萄品種，制備其新葉、老葉的乙醇提取物，測定不同乙醇提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放、萌發和游動性的影響，旨在為葡萄葉提取物應用于葡萄霜霉病防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試葡萄品種巨峰、紅乳、美人指的新葉、老葉均采自河北農業大學苗圃，其中巨峰為抗病品種，紅乳、美人指為感病品種[16-17]。從枝條頂端以下算起，第2、3張葉片視為新葉，第6、7張葉片視為老葉。

葡萄生單軸霉菌，分離自河北農業大學苗圃發病葉片。

1.2試驗方法

1.2.1葡萄葉提取物的制備將3個品種健康的新葉、老葉分別用清水洗凈晾干，放入烘箱內于60 ℃烘至恒質量，用微型植物粉碎機粉碎后過40目篩。分別取過篩的材料，按料液比1 g ∶8 mL與95%乙醇混合，在40 ℃超聲提取30 min，用4層紗布過濾；濾液于8 000 r/min離心20 min，取上清液在恒溫下旋轉蒸發至固態，最后用50%乙醇定容至原植物干樣含量為1 g/mL的提取母液[14]。分別將母液用無菌水稀釋成1、5、10、50、100 mg/mL備用。

1.2.2葡萄葉提取物對游動孢子釋放的影響將新鮮病葉采回，用清水洗凈，葉柄用脫脂棉包扎后置于鋪有紗布的培養皿中，于20 ℃培養箱中保濕培養2 d，待新孢子囊成熟，用毛筆將孢子囊刷至無菌水中，用單層鏡頭紙過濾，配成濃度為106個/mL的孢子囊懸浮液[18]。然后將不同濃度葡萄葉提取物分別與孢子囊懸浮液按體積比1 ∶1混合，分別用5%乙醇、無菌水與孢子囊懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對照，混合后放置在22 ℃光照培養箱內培養，2 h后置于200倍光學顯微鏡下觀察，每個處理觀察20個視野，記錄每個視野下游動孢子的數量（個），并計算抑制率，相關公式：

游動孢子釋放抑制率=[（對照游動孢子總數-處理游動孢子總數）/對照游動孢子總數]×100%。

1.2.3葡萄葉提取物對游動孢子萌發的影響孢子囊懸浮液的制備同“1.2.2”節，待游動孢子釋放后加入NaCl，使懸浮液中NaCl含量為10 mmol/L，輕輕搖晃以促進游動孢子停止萌發[19]。然后將不同濃度葡萄葉提取物與懸浮液按體積比 1 ∶1 混合，分別用5%乙醇、無菌水與懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對照，放入22 ℃光照培養箱中培養1 h，鏡檢游動孢子的萌發數，每個處理檢驗不少于200個獨立的游動孢子，計算游動孢子萌發抑制率，相關公式：

游動孢子萌發抑制率= [（對照游動孢子萌發率-處理游動孢子萌發率）/對照游動孢子萌發率]×100%。

1.2.4葡萄葉提取物對游動孢子游動性的影響將濃度為106個/mL的孢子囊懸浮液置于22 ℃光照培養箱中2 h，待游動孢子被釋放后，將懸浮液與不同葡萄葉提取物按體積比1 ∶1混合，分別用5%乙醇、無菌水與懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對照，5 min后置于200倍光學顯微鏡下檢查游動孢子的運動狀態[20]。每個處理觀察不少于15個視野，并記錄每個視野下具有游動性的游動孢子數量，計算每個視野下的平均值。

1.2.5數據統計及分析以上試驗均重復3次，數據采用SPSS 12.0軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放的影響

由圖1可知，隨著處理濃度的增加，3個品種葡萄的新葉和老葉提取物對游動孢子釋放的抑制率也顯著提高；當濃度為1 mg/mL時，各個品種葡萄的新葉、老葉提取物對游動孢子的釋放均無明顯抑制作用。巨峰葉片提取物處理濃度為 5 mg/mL 時，對游動孢子釋放的抑制率達90%；當濃度提高到10 mg/mL時，對游動孢子釋放的抑制率可達95%；當處理濃度為50 mg/mL及以上時可完全抑制游動孢子的釋放，且新老葉作用基本相同，與其他處理相比不存在顯著差異（圖1-a）。紅乳葉片提取物對游動孢子釋放的抑制能力較弱，新葉、老葉之間無顯著差別，當處理濃度為5、10、50 mg/mL時，對游動孢子釋放的抑制率均低于巨峰、美人指葉片提取物；當處理濃度達到100 mg/mL時，其抑制率才能達到另兩者濃度為50 mg/mL的抑制水平（圖1-b、圖1-c）。美人指葉片提取物處理濃度為5 mg/mL時，新葉、老葉提取物對游動孢子釋放的抑制率分別為75%、58%，存在顯著性差異；當處理濃度大于10 mg/mL時，新老葉提取物對游動孢子釋放的抑制率均為95%以上，且差異不明顯（圖1-c）。

2.2葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子萌發的影響

由圖2可知，當處理濃度為1 mg/mL時，3個品種葡萄的新葉、老葉提取物均不能明顯抑制游動孢子的萌發；當處理濃度為5 mg/mL時，3個品種葡萄的新葉、老葉提取物對游動孢子的萌發抑制率顯著提高，只有紅乳新葉的抑制率仍較低，為77%，其他葡萄葉提取物抑制率均在90%左右，同品種新老葉提取物之間無顯著差異；當處理濃度為10 mg/mL及以上時，3個品種葡萄的新葉和老葉提取物均能明顯抑制游動孢子的萌發，且不存在顯著差異。

2.3葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子游動性的影響

由表1可知，當處理濃度為1 mg/mL時，3個品種葡萄的新葉、老葉提取物均不影響游動孢子的游動性，并且與對照無明顯差異，巨峰葉片提取物在處理濃度為5mg/mL及以上時，使游動孢子完全失去游動性，與對照差異顯著，并且新葉、老葉的作用相同；紅乳葉片提取物在處理濃度為5 mg/mL

時，對游動孢子的游動性產生抑制作用，與巨峰處理無顯著差異，但與對照有顯著差異；在處理濃度為10 mg/mL及以上時，使游動孢子完全失去游動性，并且新、老葉之間無明顯差異；美人指葉片提取物當濃度為5 mg/mL時，對游動孢子的游動性產生抑制作用，并與對照有顯著差異，但是顯著低于巨峰葉片提取物，新葉的抑制作用也低于老葉，在10 mg/mL濃度下，對游動孢子游動性的抑制作用增強，美人指老葉提取物對游動孢子游動性的影響顯著好于新葉提取物，當濃度為 50 mg/mL 及以上時，使游動孢子失去游動性。運動中的游動孢子鞭毛透明，其形態在顯微鏡下不明顯，而失去游動性的游動孢子鞭毛變得清晰可見，并向兩側伸展（圖3）。

3結論與討論

本研究表明，3個葡萄品種新葉和老葉的乙醇提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的釋放、萌發及游動性均有良好的抑制作用。在高濃度下不同葡萄品種、葉齡的葡萄葉提取物對游動孢子均有顯著的影響且無明顯差異；在低濃度下巨峰葉片提取物的抑制效果最穩定，好于紅乳、美人指葉片提取物。相比較而言，抗病品種的葡萄葉提取物的抑制效果要好于感病品種，而同一品種的新葉和老葉之間差異較小。因此可見，在不同抗性品種、不同葉齡葡萄葉中抑菌活性物質的種類沒有差別，只是含量有所不同，這與Pezet等的研究結果[20-21]一致。結合葡萄葉提取物對游動孢子3個方面的影響和不同濃度的抑制效果，建議在應用葡萄葉提取物防治葡萄霜霉病時抗病品種提取物采用5 mg/mL以上濃度，感病品種提取物采用 10 mg/mL 以上濃度為宜。

本研究初步探討了葡萄葉乙醇提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的抑制作用，但是對于田間防治效果尚須進一步驗證。本研究發現，在處理濃度為5 mg/mL時，3個品種葡萄的新葉、老葉提取物都有游動孢子的釋放、萌發，但與對照相比其釋放的游動孢子大多數為不具游動性的畸形孢子，萌發的游動孢子也存在一定的畸形且芽管短小，其中的作用機制和活性成分尚不明確，今后還須要進一步研究。

植物源農藥產品中除有效成分外，還含有其他多種物質。有些物質表現出特殊的生物活性，例如促進植物生長、誘導植物提高抗病性和抗逆性、改善作物的品質等[22]。前人研究發現，葡萄葉有機提取物可以提高葡萄葉片內2種防御酶的活性[10]，圓葉葡萄葉乙醇提取物可以增加番茄的高度、鮮質量和根長[15]。關于葡萄葉乙醇提取物是否能誘導葡萄對霜霉病產生抗性以及對葡萄是否具有促生作用也須要做進一步研究。

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