反應溫度對臺灣乳白蟻內外源纖維素酶活力的差異影響

曾文慧++鐘俊鴻++李秋健++劉炳榮

摘要：臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus Shiraki）不僅是我國重要的經濟害蟲，也是研究低等白蟻木質纖維素二元降解系統的模式生物。將臺灣乳白蟻消化道解剖分成唾液腺/前腸+中腸（內源）與后腸（外源）2個部分，以臺灣乳白蟻生理臨界溫度區間（15～42 ℃）為反應溫度，測定內切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanohydrolasease，簡稱EG）、纖維二糖水解酶（cellobiohydrases，簡稱CBH）、β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase，簡稱BG）以及濾紙酶（filter paper，簡稱FPA）的活力，旨在探討反應溫度對臺灣乳白蟻內源與外源纖維素酶活力的影響差異。結果表明，整頭白蟻的FPA與EG酶活力隨反應溫度變化趨勢一致。整頭白蟻BG酶在22～42 ℃下反應活力無顯著差異。反應溫度對外源纖維素酶活力的影響大于對內源纖維素酶活力的影響。后腸EG、BG、CBH及FPA最佳反應溫度均為32 ℃，而相應內源纖維素酶最佳反應溫度均高于37 ℃。

關鍵詞：臺灣乳白蟻；纖維素酶；雙纖維素水解系統；反應溫度

中圖分類號： S433.89文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0091-04

臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus Shiraki）屬于低等白蟻，高效的木質纖維素降解系統不僅使它成為世界范圍內危害極大的重要經濟害蟲，也成為研究生物質能轉化的模式生物[1-2]。臺灣乳白蟻的木質纖維素降解系統由2部分組成：前腸/唾液腺及中腸組成的內源性消化系統；后腸微生物共生體組成的外源性消化系統[3-4]。一方面，低等白蟻后腸生物密度極大的共生鞭毛蟲在降解纖維素的過程中起著不可替代的主導作用。同時，大量原核微生物（細菌與古細菌）或生活在鞭毛蟲的細胞表面（ectosymbionts），或生活在鞭毛蟲的細胞內部（endosymbionts）與鞭毛蟲形成了第二重的共生關系[5-6]。另一方面，低等白蟻自身也能分泌整套由纖維素酶、半纖維素酶組成的木質纖維素降解酶系[7-8]。其中，纖維素酶主要包括內切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanase，EC. 3.2.1.4，簡稱EG）、纖維二糖水解酶（β-1，4-cellobiohydrolase，EC. 3.2.1.91，簡稱CBH）以及β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase，EC. 3.2.1.21，簡稱BG）[9-10]。

研究表明，溫度是低等白蟻取食、生存、后腸原生動物活性及消化效率[11-13]的重要影響因素。但目前為止，關于溫度對低等白蟻纖維素降解雙系統差異影響鮮有研究。臺灣乳白蟻的生理溫度臨界范圍（critical thermal range）為14.0～46.3 ℃[14]。本研究在臺灣乳白蟻生理臨界溫度范圍內，選取15、22、28、32、37、42 ℃作為纖維素酶反應溫度，分析反應溫度對內源、外源3種纖維素酶，以及濾紙酶（filter paperase，簡稱FPA）活力的差異影響，為今后更深入地闡明環境與低等白蟻宿主-共生微生物纖維素水解系統相互作用機制以及新型白蟻防治方法提供理論數據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗白蟻：供試白蟻工蟻取自本實驗室飼養的3個獨立臺灣乳白蟻巢。供試工蟻在28 ℃，相對濕度（80±5）%條件下，以蛭石保濕饑餓48 h均一化白蟻腸道，以備酶活力測定。

主要試劑包括：羧甲基纖維素鈉（sodium salt of caboxy methyl cellulose，簡稱CMC-Na，天津福晨化學試劑廠）、葡萄糖（glucose，廣州化學試劑廠）、濾紙（雙圈定性濾紙）、 D-水楊苷（D-salicin，上海晶純試劑有限公司）、對硝基苯-8-D-纖維二糖苷（p-NPC，美國Sigma公司）、對硝基苯酚（p-NP，美國Genview公司）、牛血清蛋白組分Ⅴ（albumin from bovine serum，簡稱BSA，美國Genview公司）、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，簡稱DNS，美國Genview公司）、考馬斯亮藍G-250（coomassie brilliant blue G-250，美國Genview公司）。

1.2試驗方法

1.2.1纖維素酶粗酶液制取選取乳白蟻工蟻約80頭置于0.9%（質量濃度）滅菌生理鹽水中反復漂洗之后，用濾紙吸干表面水分，放入已滅菌的干凈培養皿中。在實體解剖鏡下將白蟻腸道解剖，分成前腸/唾液腺+中腸（內源纖維素酶活力檢測段）和后腸（外源纖維素酶活力檢測段）2部分，與5頭未解剖的乳白蟻共分成3組，分別用1 mL醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH值=5.6）離心管再轉移至玻璃組織勻漿器，冰浴研磨；研磨完畢后，將勻漿液吸至離心管定容至1 mL，12 000 r/min、4 ℃冷凍離心（美國Sigma公司，3K15） 15 min，取上清，再次12 000 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，取上清即為粗酶液，于 -20 ℃ 保存待用。

1.2.2纖維素酶活力測定（1）濾紙酶（FPA）、內切葡聚糖酶（EG）及β-葡萄糖苷酶（BG）活力的測定參照Miller的方法[15]，均采用還原糖法。在1.5 mL的離心管中，分別加入120 μL 1% CMC-Na、D-Salicin及5 mm×5 mm滅菌濾紙1片，預熱5 min，然后加入12 μL酶液，37 ℃準確反應 60 min，立即加入120 μL DNS 溶液終止反應，沸水浴 5 min，冰浴冷卻，使用多功能酶標儀（victor 3 multi-label microplate reader，美國珀金埃爾默儀器有限公司）在540 nm處測定吸光度，以葡萄糖為標準物計算產物還原糖含量[16]。EG、BG、FPA酶活力定義為1 mg蛋白質在37 ℃、pH值=56反應條件下分解底物，1 min可以產生還原糖的量，表示為U/mg。每個酶切反應重復3次。（2）纖維二糖水解酶（CBH）活力測定：在 1.5 mL 離心管中加入120 μL 1 mmol pNPC底物，預熱5 min，然后加入酶液12 μL，37 ℃ 準確反應 60 min，加入120 μL Na2CO3 （0.6 mol/L）溶液終止反應，使用酶標儀測定D405 nm，從p-NP標準曲線求得p-NP含量，計算酶活力單位。CBH酶活力定義為1 mg蛋白質在37 ℃、pH值=5.6反應條件下分解p-NPC，1 min可以產生p-NP的量，表示為U/mmol。每個酶切反應測定3次。

1.2.3蛋白質濃度的測定采用考馬斯亮藍法。將粗酶液稀釋1倍，取50 μL稀釋粗酶液，加入250 μL考馬斯亮藍 G-250顯色試劑，多功酶標儀測定D595 nm，用牛血清蛋白組分Ⅴ制作標準曲線求蛋白質含量，每個樣本測定3次。

1.2.4統計學方法采用SPSS 17.0軟件分析數據。整頭白蟻、唾液腺/前腸+中腸及后腸3組樣品在不同反應溫度下的酶活力差異均采用單因素方差分析（One Way ANOVA，α=0.05）與t檢驗（LSD，α=0.05）。3巢白蟻共進行3次梯度反應溫度測定，所有誤差線為均值的標準誤差（standard error of mean，簡稱SEM）。

2結果與分析

前腸/唾液腺+中腸部分用于檢測白蟻內源性纖維素酶活性變化，4種酶標準縮寫為FPA/EG/BG/CBH-FM；后腸部分用于檢測白蟻共生微生物來源纖維素酶活性變化，4種酶標準縮寫為FPA/EG/BG/CBH-H；整頭白蟻4種酶指標縮寫為FPA/EG/BG/CBH-W。

2.1反應溫度對內源與外源纖維素酶降解濾紙能力的差異影響

FPA-W活力在反應溫度為22 ℃達到最大值，且在15、22、37、42 ℃下反應測得各FPA酶活力之間無顯著差異。FPA-W在28、32 ℃下反應活性相對較小（圖1-A）。后腸對濾紙的降解能力受反應溫度影響較內源性纖維素酶大（FPA-FM 組內F=3.536，P<0.05；FPA-H組內F=2875，P<0.05）。FPA-H最佳反應溫度為32 ℃，顯著大于其他反應溫度下FPA-H活力。FPA-FM對濾紙的最佳降解溫度為42 ℃。在15～32 ℃時，FPA- H活力大于FPA-FM活力，而在 37～42 ℃時，FPA- FM活力大于FPA-H活力（圖1-B）。

2.2反應溫度對內源與外源內切葡聚糖酶活力的影響

EG- W的最佳反應溫度為37 ℃，且在22、37、42 ℃下反應測得各EG-W酶活力之間無顯著差異。在28、32 ℃下，EG-W反應活性相對較小（圖2-A）。后腸微生物群落對濾紙酶的降解能力受反應溫度影響較內源性纖維素酶大（EG-FM 組內F=7.111，P<0.05；EG-H組內F=11.107，P<0.05）。EG-H 最佳反應溫度為32 ℃，顯著大于其他溫度下EG-H活力。在15、22、32、37、42 ℃下，EG-FM反應活性兩兩之間無顯著差異（圖2-B）。

2.3反應溫度對內源與外源β-葡萄糖苷酶活力的影響

BG-W活力受反應溫度影響小，組內無顯著差異（BG-W 組內F=2.040，P=0.145）（圖3-A）。BG -FM與BG-H酶活力在15～32 ℃下反應， 隨溫度升高而增加，而反應溫

度升高至37～42 ℃，BG-FM活力顯著增加，BG-H活力則顯著降低（圖3-B）。

2.4反應溫度對內源與外源纖維二糖水解酶的影響

CBH-W最佳反應溫度為37 ℃，且在37、42 ℃時，CBH-W的酶活力之間無顯著差異（圖4-A）。CBH-FM在15～32 ℃內，反應活力變化整體趨勢隨溫度升高而增加。在22～32 ℃之內，CBH-H活性隨反應溫度升高逐漸增加，且在32 ℃時，CBH-H活力達到最高值，反應溫度再升高活力顯著下降（圖4-B）。

3結論與討論

低等白蟻對木質纖維素的高效降解通常認為是內源與外源（后腸共生微生物）降解系統的增效協同作用[3]。溫度是影響低等白蟻取食消化等生理功能的重要物理因子[11-13]。本試驗選取臺灣乳白蟻生理臨界溫度范圍內的15、22、28、32、37、42 ℃作為纖維素酶反應溫度，分析研究了反應溫度對乳白蟻工蟻內源與外源3種纖維素酶及濾紙酶活力的差異影響。

整頭白蟻的FPA、EG、BG、CBH活力隨反應溫度的變化為內源及外源纖維素酶活力隨反應溫度變化的綜合作用。其中，FPA-W與EG-W的活力隨反應溫度變化的趨勢相似，BG-W活力則受反應溫度影響小，組內無明顯差異。濾紙全酶活是衡量纖維素酶降解天然纖維素能力的指標。EG首先作用于非結晶態纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機水解糖苷鍵，分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚糖。BG再將纖維二糖和水溶性糊精水解成葡萄糖。因而，只需要EG與BG等2種酶的參與即能將一部分纖維素水解成葡萄糖[14]。結果表明，白蟻對天然纖維素的降解可能極大地被EG活力所影響。

本試驗結果表明，外源（后腸）共生微生物纖維素酶對溫度的敏感性大于內源性（唾液腺/前腸+中腸）纖維素酶。而且，內源性纖維素酶的最佳反應溫度高于外源共生微生物纖維素酶的最佳反應溫度。其中，FPA-H、EG-H、BG-H 及CBH-H的最佳反應溫度均為32 ℃，且活力均在37 ℃后顯著下降。然而，FPA-FM與EG-FM在反應溫度升至42 ℃時，活性未出現明顯影響。在15～42 ℃范圍內，BG-FM 與CBH-FM活力整體隨反應溫度上升而增加，且CBH-FM活力在42 ℃有顯著增加。由此可見，32 ℃是內源與外源酶發揮作用的重要分歧溫度。研究表明，臺灣乳白蟻的生理活性溫度范圍為14.0～46.3 ℃[17]，最佳取食溫度范圍為30～35 ℃[18-20]。因此，后腸纖維素酶最佳反應溫度處于最佳取食溫度范圍內，而內源纖維素酶的最佳反應溫度則高于該溫度范圍。一方面，低等白蟻后腸消化系統被認為對木質纖維素的降解起主導性作用，例如：北美散白蟻（Reticulitermes flavipes Kollar）的內源與外源纖維素水解系統分別提供33%與66%的葡萄糖[10]，由此推測，臺灣乳白蟻后腸纖維素酶最佳反應溫度是與乳白蟻最佳取食溫度相互對應的，即在最適取食溫度下臺灣乳白蟻降解木質纖維素也主要依靠后腸共生微生物消化系統。另一方面，纖維素在經過白蟻唾液腺和中腸上皮細胞分泌的各種消化酶的分解后，大部分較易消化的木質纖維素在到達中腸末尾時已被降解吸收[21]，表明內源纖維素酶系統的獨立性。因此，在40 ℃生理極限高溫環境下，臺灣乳白蟻的內源性纖維素降解系統對白蟻的生存起到了非常重要的作用。

白蟻對周圍環境的適應能力與腸道微生物的組成以及腸道微生物的消化能力有著密不可分的聯系[22]。闡明溫度與低等白蟻木質纖維素消化系統之間的相互作用機制還需要進一步研究。

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