己烯雌酚人工抗原的合成及抗血清的制備

楊興東++胡驍飛+王方雨++曾憲垠

摘要：由己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）經過一系列化學反應，合成含有1個羥基活性基團的半抗原己烯雌酚-單羧基丙基醚（DES-MCPE）；應用活潑酯法，使DES-MCPE與牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶聯，合成人工免疫抗原DES-BSA和包被抗原DES-OVA，采用紫外分光光度法（UV）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行鑒定，初步判定偶聯成功。用DES-BSA以60 μg/只的劑量免疫3只BALB/c小鼠，4次免疫后，采集血清，使用間接ELISA和間接競爭ELISA分別測定抗血清的效價與抑制，3只小鼠的效價均可達到1×104以上，其中2號小鼠的半抑制率（IC50）為18.221 μg/L，表明已獲得靈敏、特異、高效價的抗血清。

關鍵詞：己烯雌酚；完全抗原；人工合成；抗血清；ELISA；高效價；靈敏

中圖分類號： S852.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0149-03

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是一種人工合成的非甾體雌激素，具有促進動物生長、提高瘦肉率的作用，曾經作為促生長劑在畜禽生產中得到普遍應用。但DES對人類有很強的致畸、致癌等毒副作用[1-3]，我國及大多數國家均明確規定禁止在畜牧養殖中使用DES。為降低動物生產成本，不規范使用己烯雌酚的現象仍然存在。傳統的理化檢測技術雖然能夠監測動物源性食品中的DES殘留，但其存在用時長、費用多、程序繁瑣等缺陷，因此急需發展一種迅速、簡便、敏感、精確、價廉的分析方法[4]。本試驗旨在合成DES人工抗原和制備抗DES抗血清，為DES殘留血清學檢測的建立打下基礎。

1材料與方法

1.1試劑和溶液

DES、4-溴丁酸乙酯，Sigma產品；羥琥珀亞酰胺（NHS）和N，N-二環己基碳二亞胺（DCC），Fluka公司；牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA），弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA），Pierce產品；羊抗鼠酶標二抗（GaMIgG-HRP），華美生物工程有限公司；二甲基亞砜、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺均為AR級。

ELISA相關試劑配制：（1）洗液（PBST）：含0.05%的Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH值為7.4）；（2）間接ELISA和間接競爭ELISA所用的稀釋液、封閉液均為含50 mL/L豬血清的PBST；（3）包被液（CBS）為 0.05 mol/L pH值9.6的碳酸鹽緩沖液；（4）顯色液為四甲基聯苯胺（TMB）的醋酸-檸檬酸緩沖液；（5）終止液為2 mol/L的H2SO4溶液。

1.2主要儀器設備

U-3000紫外掃描儀（UV），日本島津公司；凝膠成像系統及分析軟件，Syngene公司；JM-250電泳儀，大連捷邁科貿有限公司；Bio-Rad 550型酶標儀，美國Bio-Rad公司；超凈工作臺，美國Forma Scientific公司；93-3定時恒溫雙向磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠；3K-18高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；HI9321酸度計，美國HANNA公司；Jouan-RC1010z真空濃縮儀，法國Jouan公司；AE260電子天平，德國METTLER公司。

1.3實驗動物

SPF級6～8周齡的雌性BALB/c小白鼠，購自鄭州大學醫學院實驗動物中心，由河南省農業科學院動物免疫學重點開放實驗室飼養。

1.4方法

1.4.1DES人工抗原的合成

1.4.1.1己烯雌酚-單羧基丙基醚（DES-MCPE）的合成（1）精確稱量54 mg DES溶于2 mL無水二甲基亞砜（DMSO），加入27.5 mg無水K2CO3，在避光條件下，室溫攪拌反應1.5 h；（2）加入4-溴丁酸乙酯（C6H11BrO2）17 mg，室溫，避光，攪拌反應8 h；（3）反應產物轉移到10 mL預冷pH值 2.0 的稀鹽酸溶液中，加入醋酸乙酯（C4H8O2）進行萃取，雙蒸水沖洗、放入真空濃縮儀中，抽提有機溶劑；（4）抽提后的產物加入適量的甲醇（CH3OH）溶液進行溶解，再加入 2 mol/L 氫氧化鈉溶液，全部溶解后后，逐滴加入適量的HCl溶液，使溶液pH值在2～4之間，重復上述分離步驟，C4H8O2萃取，雙蒸水沖洗、真空干燥，得到目標產物（DES-MCPE）[5]。

1.4.1.2DES-BSA免疫原、DES-OVA包被原的制備（1）稱取DE-MCPE 42 mg溶于2 mL二甲基亞砜（DMSO），將25 mg DCC溶解在0.6 mL無水二甲基甲酰胺，加入15 mg NHS，暗處、室溫下攪拌反應4 h。（2）2 900 r/min離心 5 min，棄去沉淀，收集上清。（3）精確稱量BSA 60 mg溶于 2 mL 的pH值8.0的PBS中，冰浴，逐滴加入1 mL無水二甲基甲酰胺。（4）將上清液緩慢逐滴滴加到BSA溶液中，4 ℃攪拌8 h。（5）將反應產物加入透析袋中，透析袋放入盛有 1 000 mL PBS緩沖液的燒杯中，將燒杯轉移到4 ℃冷凍室開始透析，透析液需每天更換3次，持續透析3 d。（6）透析完成后，透析袋內溶液移入離心管，離心5 min，收集上清液，用1 mL PE管分裝，-20 ℃存放待用。包被原DES-OVA的制備過程與DES-BSA相同，OVA的劑量為70 mg[6]。

1.4.2DES人工抗原的鑒定

1.4.2.1UV鑒定使用核酸蛋白檢測儀DES-BSA溶液的質量濃度，用PBS配制BSA溶液使其濃度與DES-BSA溶液的濃度相同，用二甲基甲酰胺（DMF）與PBS體積比為4 ∶6的混液配制DES標準溶液，在波長220～350 nm之間，用紫外吸收法分別測定上述溶液的特征峰，通過觀察吸收峰的特征變動，判定偶聯成功與否，依據Yang等報道的方法[7]，推算出DES-MCPE分別與BSA、OVA的分子偶聯比率。

1.4.2.2SDS-PAGE凝膠電泳鑒定電泳溶液的配制依照Guo等的報道[8]來進行：（1）濃縮膠ω=5%；分離膠ω=12%；濃縮膠電壓65 V；分離膠電壓100 V；（2）加入樣品 20 μL，其中含免疫原3 μg；（3）考馬斯亮藍染色7～8 h；（4）在脫色液中脫色6～7 h；（5）可以通過測定物的分子質量的大小、條帶位點的變化能夠判定結合與否；（6）利用紫外凝膠成像系統分析軟件，推算DES-MCPE與BSA的分子偶聯比[9]。

1.4.3DES多抗血清的制備（1）用人工免疫原DES-BSA以60 μg/只的劑量，背部多點皮下注射的免疫方式來免疫3只實驗小鼠；（2）第1次免疫，450 μL FCA和450 μL DES-BSA的無菌PBS溶液進行混合，利用勻漿機乳化5～10 min；（3）28 d后加強免疫，用450 μL DES-BSA的無菌PBS溶液與450 μL FIA混合并乳化，注射劑量與第1次免疫劑量相同，總共免疫4次，每次間隔時間為21 d；（4）第4免10 d后剪斷免疫小鼠的尾稍，吸取10 μL血液放入裝有990 μL無菌PBS的1 mL PE管中，在振蕩器上振蕩使之充分混合均勻，離心5 min，收集上清液，于4℃存放待用。

1.4.4DES多抗血清的鑒定

1.4.4.1效價測定采用間接ELISA測定DES抗血清效價[10]，其步驟如下：第1步，以DES-OVA為包被抗原（2 μg/L），50 μL/孔，進行包板，37 ℃溫育2 h，PBST洗板4次（每次間隔3 min），下同；第2步，37 ℃，5%的豬血清以 220 μL/孔 的劑量封閉60 min，洗板；第3步：稀釋100倍的DES抗血清以50 μL/孔的劑量加入第1孔，然后利用5%的豬血清進行倍比稀釋，同時設陰性對照（negative control，NC）和空白對照（blank control，BC），37 ℃溫育15 min，洗板；第4步：加入GaMIgG-HRP[V（GaMIgG-HRP） ∶V（封閉液）=1 ∶1 000]，50 μL/孔，37 ℃溫育30 min，洗板；第5步：各孔加入TMB（四甲基聯苯胺）的CH3COOH-C6H8O7緩沖液 50 μL，室溫條件下靜置2～6 min；第6步：各孔加入2 mol/L硫酸溶液50 μL，使反應結束，利用酶標儀進行測定；第7步，結果判斷，以待測孔D450 nm≥NC D450 nm的2.1倍（P/N≥2.1），判為陽性。

1.4.4.2敏感性鑒定間接競爭ELISA（ci-ELISA）方法[11]測定抗血清對DES的半數抑制質量濃度（IC50），以IC50判定敏感度，操作步驟與間接ELISA類似，區別在于第3步分別添加D450 nm值為1.0的3只小鼠血清50 μL和不同質量濃度的抑制劑（DES溶液）50 μL。

1.4.4.3特異性測定交叉反應（CR）試驗鑒定其特異性。選用己烯雌酚（DES）、己烷雌酚（HEX）、雙烯雌酚（DIEN）和雌二醇（E2）等作為競爭物，用ci-ELISA測定各競爭物的IC50，交叉反應率（CR%）是以抗血清對DES的IC50與各競爭物的IC50之比的百分數。

2結果與分析

2.1人工抗原鑒定結果

2.1.1UV鑒定結果DES-BSA的吸收峰向右稍有偏移，DES的吸收峰在240～245 nm處，BSA的吸收峰在278～280 nm 處（圖1），證明DES和BSA已發生偶聯。推算出 DES-MCPE與BSA、OVA的分子偶聯比分別為1 ∶12.8、1 ∶11.5。

2.1.2SDS-PAGE鑒定結果人工合成的DES-BSA的顯色條帶位于偶聯物之后，其泳動速度小于DES（圖2），DES分子質量的大小與樣品在SDS-PAGE中遷移距離成反比，結果分析表明，DES-BSA的分子量比BSA的大，證明BSA與DES成功偶聯；應用紫外凝膠成像系統分析軟件推算出 DES-BSA的分子量為7.039×104，BSA的分子量為6.62×104，BSA與DES的分子結合比約為1 ∶12.8，與UV鑒定結果基本一致。

2.2DES pAb的鑒定結果

2.2.1間接ELISA檢測結果表1顯示，免疫的3只 BALB/c 小鼠的多抗血清的效價均達到1.0×104以上，證明DES多克隆抗體（pAb）滴度高，DES-BSA免疫原性良好。

2.2.2敏感性鑒定結果3只免疫小鼠的抗血清都有抑制生成（表2），其中抗血清抑制效果最優的是2號小鼠（圖3），以2號小鼠抗血清的抑制濃度的對數值為橫坐標，其對應的B/B0值為縱坐標進行繪圖，曲線回歸分析顯示兩者存在良好的線性關系，其線性回歸方程為y=-0.397 5x+1.001 2，r2=0.977 3。據此回歸方程能夠計算出對DES抗血清的IC50為18.221 μg/L，證明所獲得的DES抗血清的敏感性較高。

2.2.3特異性鑒定結果DES抗血清與己烷雌酚、雙烯雌酚的交叉反應率分別為8.09%、3.63%，與其類似物無交叉反應（表3）。證明DES多抗血清擁有較好的選擇性。

3討論

3.1DES人工抗原的制備

依據DES免疫學測定技術的報道，歸納活化DES重要的手段有2種：一種是改造己烯雌酚中的酚羥基產生醚鍵；另一種是改造DES中的酚羥基形成酯鍵，對DES分子含有2個對稱結構的酚羥基進行衍生反應，對其可直接與琥珀酸酐衍生使之生成具有交聯功能基團的化合物，然后再與載體交聯。要對其中一個酚羥基進行化學改造，必須從反應物的量上加以嚴格控制，按一定比例反應后，保證生成的產物是DES-HS。我們按照此法對DES進行多次改造，但結果沒有新的產物產生。Liu等報道動物體內酯酶使機體內的酯鍵處于不穩定狀態，而且免疫原性不理想[12]。本研究為了避免這一現象的產生，選取后一種連接方式。

3.2DES人工抗原的鑒定

核磁共振碳譜、IR、標記抗原示蹤法[13]、UV[14]、聚丙烯酰胺凝膠電泳等是檢測小分子抗原經常使用的方法，前2種方法能夠很好地測出被檢物質的化學式，但是操作者需要擁有辨析圖譜的能力和相當程度的實際動手經歷，而且檢測成本高昂，第3種方法要求對小分子作標記，還要求檢測合成抗原的放射強弱，操作過程步驟繁瑣、所需時間長。使用后2種方法鑒定本試驗合成的抗原，結果顯示，DES與BSA已經發生偶聯，斷定兩者是否發生偶聯的關鍵是合成的DES-BSA抗原免疫BALB/c小鼠后，是不是生成了針對DES的抗體[15]。本試驗測定的3只BALB/c小鼠的多克隆抗體的效價都在 1×104以上，都對DES有抑制，最佳的IC50為 18.221 μg/L，結果表明，本研究合成的抗原可以激發機體產生高親和力的特異性抗體，充分證明該合成物是有效的。

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