接種菌劑對發酵床墊料中微生物數量與酶活性的影響

肖翰+雷平++劉標++許雋++杜東霞++尹紅梅

摘要：以發酵床墊料與豬糞為原料，研究接種微生物菌劑對發酵床墊料中微生物數量和酶活性變化的影響。結果表明，接種菌劑試驗組微生物數量高于對照組；接種菌劑提高了發酵床墊料溫度，延長了高溫保持的時間；接種菌劑有效地提高了發酵過程中各種酶的活性和峰值。酶活性的大小因酶種類和發酵時期的不同而各異，過氧化氫酶、纖維素酶在發酵初期活性高，B試驗組、對照組過氧化氫酶活性峰值分別為8.26、4.72 U/g，纖維素酶活性峰值分別為 44.8、32.4 U/g；蛋白酶活性峰值出現在中期，B試驗組、對照組蛋白酶活性峰值分別為36.2、27.6 U/g。

關鍵詞：接種菌劑；發酵床；微生物數量；酶活

中圖分類號： S815.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0157-02

隨著我國養殖業的迅速發展，畜禽糞尿及污水排放造成的環境污染問題日趨嚴重，加強畜禽養殖污染的防治已迫在眉睫[1]。發酵床養殖技術是為了實現畜禽養殖零污染、零排放的新型養殖技術。我國從20世紀90年代后期引進和應用該技術，隨后迅速蔓延開來[2]。該技術將稻殼、鋸末屑、粉碎的農作物秸稈等墊料、多種不同功能的飼料級微生物和米糠、紅糖等輔助發酵劑按一定比例混勻，鋪在發酵舍內，自然發酵，形成微生物發酵床，將畜禽飼養其上，利用微生物對畜禽糞尿原位降解，達到生態環境零污染的目的。微生物對畜禽糞尿的分解代謝能力取決于酶的活性[3]，分解的底物越豐富多樣，所需要的酶系統就越復雜[4]。本研究初步探討接種微生物菌劑對發酵床墊料中微生物含量及部分酶活的影響，以期為微生物菌劑在發酵床墊料中的應用提供一些的理論依據。

1材料與方法

1.1菌劑

自制的A（枯草芽孢桿菌）、B（枯草芽孢桿菌+干酪乳桿菌）、C（干酪乳桿菌）3種菌劑，3種菌劑活菌總數均為1.0×109 CFU/mL。

1.2試驗方法

1.2.1試驗設計本試驗在湖南省長沙市長沙縣某豬場發酵床中進行。發酵床墊料由鋸末屑、稻殼、稻草按5 ∶3 ∶2體積比配制而成，墊料深度約為70 cm，接種的菌劑按0.1%的量噴灑到墊料中，充分拌勻，含水率保持在55%左右。發酵床在夏季采用負壓抽風降溫。設置添加微生物菌劑A、B、C 3個處理組和不加菌劑的對照組，每個處理3次重復。

1.2.2采樣時間及方法本試驗于2015年7月1日開始，分別在5、10、30、60、90、120 d采樣，采樣點位于墊料表層下20 cm處，采用5點采樣法取樣。

1.2.3分析項目及方法在每個試驗組墊料20 cm處插溫度計，每天11：30測溫度；采用平板菌落計數法測定墊料中微生物總量；采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性[5]；采用酪氨酸比色法測定蛋白酶活性[6]；采用DNS法測定纖維素酶活性[7]。所有檢測項目均為3個重復，取其平均值。

1.2.4數據統計分析采用SPSS 16.0對數據進行處理分析。

2結果與討論

2.1發酵床墊料溫度變化

溫度是影響微生物活性的關鍵因素，且能很好地反映發酵所處的狀態[8]。從圖1可以看出，試驗組與對照組墊料 20 cm 處溫度變化趨勢基本一致，可分為升溫階段、高溫階段、降溫階段與溫度穩定階段；試驗組與對照組在50 ℃以上高溫保持的時間不同，A、B、C試驗組、對照組高溫保持的時間分別為11、13、11、4 d；進行到20 d后，試驗組20 cm處墊料溫度一直維持在40 ℃左右，而對照組溫度接近室溫。可見試驗組溫度更利于微生物生長繁殖，從而有效地促進畜禽糞便中有機物的降解。統計分析表明，試驗組A、B、C之間溫度變化無明顯差異，但試驗組與對照組之間溫度變化差異明顯。

2.2發酵床墊料微生物含量變化

用平板計數法對發酵床墊料中微生物進行計數。由表1可知，在試驗初期5 d，接種了有益微生物菌種的A、B、C試驗組微生物數量迅速達到峰值，分別為5.8×1010、9.5×1010、23×1010 CFU/g，對照組微生物含量為7.2×109 CFU/g。這可能是因為發酵初期墊料中富含易分解的有機物，為中溫和耐高溫微生物提供豐富的營養，使其進行快速自身增殖，從而使其數量迅速增加。當試驗進入15 d時，A、B、C試驗組與對照組微生物數量分別為2.6×108、8.5×108、5.6×108、6.3×

107 CFU/g（表1），相對于初期微生物含量有大幅度下降，可能是由于連續高溫和營養物質的消耗，大部分中溫性微生物進入休眠或衰亡狀態所致。試驗進行到30 d后，中溫微生物又開始大量繁殖，微生物數量有所上升。試驗進行到90 d時，A、B、C試驗組與對照組微生物數量分別為 9.2×108、1.6×109、6.5×108、4.8×107 CFU/g（表1），試驗組墊料中微生物含量高，有利于畜禽糞尿的分解。試驗過程中，A、B、C試驗組微生物的數量始終比對照組高1個數量級以上，差異明顯。

2.3接種菌劑對墊料中酶活性的影響

在發酵床養豬模式中，豬糞尿降解的生物化學過程都是在相關酶參與作用下進行的，故研究墊料中的酶活性，有助于了解墊料環境對豬糞尿降解能力的影響[9]。

2.3.1過氧化氫酶相關研究認為，過氧化氫酶活性與有機質及微生物含量有關。由圖2可以看出，A、B、C試驗組與對照組墊料中過氧化氫酶均呈先上升后緩慢下降的趨勢，均在10 d達到最大值，分別為7.81、8.26、8.15、4.72 U/g，A、B、C試驗組墊料之間的酶活性差異不明顯，而各試驗組的酶活性明顯高于對照組。過氧化氫酶活性初期上升中后期緩慢下降，可能是因為初期墊料中有機質含量高，中后期有機質大量降解，微生物數量和種類減少[10-11]。

2.3.2蛋白酶蛋白酶是參與環境氮循環最重要的酶類之一，主要參與含氮物質的分解和氨基酸、蛋白質及其他含氮有機物的轉化[12]。從圖3可知，各處理蛋白酶活性變化趨勢相同，初期墊料中蛋白酶迅速上升，中后期呈緩慢下降趨勢；試驗組A、B、C與對照組酶活均在30 d時達到最大值，分別為36.5、36.2、38.3、27.6 U/g，各試驗組之間的蛋白酶活性差異不明顯，但各試驗組蛋白酶活性明顯高于對照組，表明接種菌劑能提高發酵床墊料中的蛋白酶活性。

2.3.3纖維素酶纖維素降解與碳元素代謝緊密相關，纖維素酶是碳循環中重要酶之一，其活性變化可以間接反映堆肥發酵過程中碳素物質的降解情況[13-14]。本研究試驗組和對照組纖維素酶活性均呈先迅速上升后逐漸下降的趨勢（圖4）。在發酵初期，微生物快速繁殖，纖維素酶活性不斷上升，由圖4可見，試驗組A、B、C和對照組均在5 d達到峰值，分別為43.2、44.8、42.5、32.4 U/g，對照組與各試驗組纖維素酶差異明顯。試驗進入高溫期后，纖維素酶活性迅速下降，這可能是由于纖維素的主要分解菌——真菌不耐高溫，大量死亡或者休眠所致。進入降溫期后，酶活性下降趨勢減緩。試驗組纖維素酶活性在各取樣點均明顯高于對照組，可能是由于接種的外源菌劑對纖維素酶產生一定的促進作用。

3小結

接種菌劑能夠加快發酵床墊料溫度升高，延長高溫保持的時間。A、B、C試驗組與對照組高溫保持的時間分別為11、13、11、4 d，試驗組與對照組之間高溫期間溫度變化差異明顯。

在試驗過程中，試驗組和對照組中的微生物總量變化趨勢相似，均經歷了升高—降低—升高的過程。但試驗期間，A、B、C試驗組微生物的數量始終比對照組高1個數量級以上，差異明顯。

接種菌劑后能明顯提高墊料的酶活性。整個試驗過程中，試驗組與對照組所檢測的酶活性變化趨勢相似，但所有試

驗組的酶活性都比對照組的高，這說明接種菌劑可以提高墊料中相關酶的產生，加快有機質的分解和轉化，有效促進豬糞尿的降解。

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