黑麥草幼苗對凍融及酸沉降的生理響應特征

李晨++包國章++成文革++李子勇++李艷芳

摘要：以黑麥草品種冬牧70為材料，研究凍融及pH值4.5模擬酸沉降條件對黑麥草幼苗體內抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質含量的影響。結果表明，在凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）含量呈上升趨勢，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性明顯提升，最高值分別為 107.35、6.23 U/mg；在pH值4.5酸沉降脅迫下，黑麥草幼苗體內可溶性蛋白含量逐漸降低，在-2 ℃時降到最低點，下降了20.37%，可溶性糖、丙二醛含量隨溫度下降而降低，最低值分別為10.42 mg/g、17.61 μmol/g；凍融與酸沉降復合脅迫處理對黑麥草幼苗的作用高于單一脅迫的作用效果，黑麥草幼苗體內可溶性蛋白、丙二醛含量、POD活性呈上升趨勢，可溶性糖含量、SOD活性分別下降。試驗結果表明，黑麥草幼苗對凍融和酸沉降逆境脅迫存在著明顯的相互適應現象，對凍融及酸沉降型傷害有很強的適應性，且有一定的耐酸性和耐寒性。

關鍵詞：黑麥草幼苗；凍融脅迫；酸沉降脅迫；生理特性

中圖分類號： S181文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0159-04

二年生黑麥草（ryegrass）是我國重要的牧草和草坪草之一，廣泛分布于溫帶地區(qū)，具有抗寒性強、覆蓋能力強、返青早、抗病蟲害能力強等特性[1-2]。黑麥草富含蛋白質、礦物質及維生素，其經濟利用價值較高。冬牧70黑麥草是從美國引進的越年生禾本科植物，是我國北方重要的牧草和草坪草之一，于20世紀90年代初引入我國，種植冬牧70黑麥牧草是改善我國北方農區(qū)春季飼草嚴重不足現狀的可行途徑之一，具有巨大的經濟效益和社會效益。

凍融是指氣候的日、年和多年變化導致特定氣候區(qū)域地球表層一定范圍的土凍結和融化作用，地球上受凍融作用的面積約占全球陸地總面積的70%，我國受凍融作用的面積約占國土陸地總面積的98%。凍融過程引起的環(huán)境改變對植物生長發(fā)育產生一系列直接或間接影響，使植被形態(tài)特征和生理功能等方面形成了特殊的適應性。揭示黑麥草對逆境環(huán)境的適應機制是培養(yǎng)抗寒性強的黑麥草品種的關鍵，這有助于采取有效的措施減輕低溫對植物造成的危害。

酸沉降脅迫對植物的生長發(fā)育會產生嚴重不利影響，這已成為全球性環(huán)境污染問題之一。研究黑麥草幼苗對模擬酸沉降生理指標的影響，可以了解黑麥草抗酸沉降的能力，為研究植物對酸沉降脅迫適應能力提供理論依據。

過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）是清除活性氧的關鍵酶，其活性的高低反映了植物抗逆性的強弱，植物能通過應激性反應，激活抗氧化劑和誘導抗氧化酶的活性，減弱膜脂過氧化作用，保持膜的穩(wěn)定性[3]。丙二醛（MDA）從膜上產生的位置釋放出后，可與蛋白質、核酸反應，引起膜蛋白與膜內脂的變化，從而改變細胞膜系統(tǒng)。可溶性糖作為滲透調節(jié)物質和信號物質，可減緩由脅迫造成的生理代謝不平衡。

為此，本研究將通過凍融及酸沉降脅迫的方法，測定黑麥草幼苗體內可溶性蛋白含量、MDA含量、POD活性、SOD活性和可溶性糖含量這些生理指標在逆境脅迫中的變化和恢復能力，為揭示牧草和草坪草抗凍能力及防治酸沉降對其危害提供理論依據。

1材料與方法

1.1試材培養(yǎng)

試驗于2015年9月在吉林大學環(huán)境與資源學院室內實驗室進行。供試材料為冬牧70黑麥草（ryegrass），由吉林省農業(yè)科學院種子部門提供。

挑選籽粒飽滿、大小均勻的種子，用0.1% KMnO4溶液進行消毒，溶液消毒2 h后取出并以礦泉水沖洗干凈備用。將種子整齊排放在鋪有2層濾紙的長方形托盤（30 cm×40 cm）內，放于SPX-300光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，其溫度設定為25 ℃，每天光照12 h，加水4次，保持濾紙濕潤。培養(yǎng) 7 d 待幼苗長至16 cm時，選取長勢一致的幼苗用于試驗。

1.2模擬酸沉降母液的配制

根據吉林省長春市天然降水pH值及離子水平，依據文獻[4]方法配制模擬酸沉降母液，考慮天然降水離子成分的復雜性，選用礦泉水配制模擬酸沉降的原溶液。用濃硫酸和濃硝酸（SO42- ∶NO3-=5 ∶1）配制pH值為4.5的酸沉降母液，用PHS-3C型雷磁酸度計測定與校核。

1.3試驗方法

1.3.1人工凍融試驗把試驗中需要凍融脅迫的黑麥草幼苗樣品標記好后進行融凍—凍融處理。融凍試驗處理為每2 h降溫6 ℃，凍融試驗為每2 h升溫6 ℃。試驗的溫度梯度設計為10、4、-2、4、10 ℃，融凍溫度階段為10 ℃—-2 ℃，凍融溫度階段為-2 ℃—10 ℃。每2 h變溫隨即取樣，重復取6份樣本進行指標測定。

1.3.2模擬酸沉降試驗取1盤鋪放均勻的黑麥草種子，標記為酸沉降組進行試驗。培育7 d，待種子長出幼苗后，對酸沉降組均勻滴加50 mL酸沉降溶液。滴加時間為09：00，放置24 h后，進行指標測定。每2 h取樣1次，重復抽取6份樣本進行試驗測定。

1.4測定生理指標

硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛、可溶性糖含量[5]；考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量[5]；SOD、POD活性均用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定，用分光光度計進行測定。每個指標均設6組平行樣。

1.5數據處理

采用Origin Pro 8.5繪制圖表，用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行相關數據分析，圖中數據均為6次重復測定值的平均值。

2結果與分析

2.1凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內蛋白質含量的影響

如圖1所示，與凍融+酸沉降復合脅迫相比，經凍融脅迫的黑麥草幼苗體內蛋白質含量高于復合脅迫；在融凍階段，當溫度下降到-2 ℃時，黑麥草幼苗體內可溶性蛋白含量達到最高值，為0.95 mg/g，比復合脅迫下的蛋白質含量增加了15.83%；在凍融階段，溫度回升到10 ℃時，可溶性蛋白含量逐漸下降，復合脅迫組、凍融組蛋白質含量分別為 0.57、0.70 mg/g。這說明低溫脅迫可使黑麥草體內積累滲透調節(jié)物質，增加了其可溶性蛋白含量，黑麥草自身的抗寒性可提高細胞的保水能力，保護生物膜及防止活性氧對膜脂和膜蛋白的氧化作用[6]。在融凍—凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內抗逆蛋白質合成量快速增加，使束縛水相對增多，降低了幼苗體內細胞結冰而致死的概率，起到一定的抗寒作用[7]。經pH值4.5酸沉降脅迫處理后的黑麥草幼苗體內蛋白質含量先升高隨后下降，在溫度為-2 ℃時，降到最低值0.54 mg/g，在4 ℃時，達到最高值，為0.64 mg/g。本試驗中，酸沉降脅迫下的黑麥草幼苗體內可溶性蛋白含量低于復合脅迫（P<0.05），降幅為3.03%～29.03%。這是由于在酸沉降脅迫下黑麥草體內的蛋白質遭到破壞，產生逆境脅迫生理效應，從而誘發(fā)幼苗體內自由基反應，破壞細胞膜結構的完整性，導致黑麥草體內細胞代謝紊亂，這與黃開志關于模擬酸雨對蔬菜細胞透性的影響研究結果[8]一致。黑麥草幼苗經凍融及酸沉降復合脅迫處理后，可溶性蛋白質含量隨溫度降低而升高，在溫度為-2 ℃時上升到最高值，為0.82 mg/g。與經酸沉降脅迫的黑麥草幼苗相比，經凍融處理的黑麥草幼苗可溶性蛋白質含量均明顯升高。

2.2凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內可溶性糖含量的影響

在pH值4.5酸沉降脅迫下，與凍融+酸沉降復合脅迫下相比，黑麥草幼苗可溶性糖含量明顯升高，上升了 27.54%～44.49%；在溫度為4 ℃時，達到最高值，為 13.9 mg/g，隨著溫度的逐漸下降，在-2 ℃時，可溶性糖含量降到最低值，為10.42 mg/g（圖2）。這表明酸沉降不僅嚴重影響黑麥草葉片對氮素的吸收和利用，也阻礙了莖葉中的可溶性糖向根系運輸，造成幼苗生長速率下降、葉片變黃，表現出明顯的傷害癥狀，這與童貫和等關于小麥幼苗體內可溶性糖的影響研究結果[9]一致。在凍融脅迫下，與復合脅迫相比，黑麥草幼苗體內可溶性糖含量隨溫度降低而顯著升高，在-2 ℃時達到最高值，為15.76 mg/g，在溫度為10 ℃時降到最低值，為13.10 mg/g，降低了16.88%。本試驗結果顯示，凍融脅迫下黑麥草幼苗體內的可溶性糖類含量呈上升趨勢，這表明凍融脅迫能對植物溶質的積累和滲透起到調節(jié)作用[10]。在凍融+酸沉降復合脅迫條件下，黑麥草幼苗體內可溶性糖含量隨溫度下降而降低，在溫度降到最低點-2 ℃時，得到最小值8.77 mg/g。分析可得，低溫脅迫下黑麥草幼苗體內會大幅度地積累可溶性糖類，其抗寒性也隨之增強。

2.3凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內MDA含量的影響

由圖3可知，在凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內MDA含量高于凍融+酸沉降復合脅迫下的含量，增加10.74%～12.88%；在融凍階段，溫度為-2 ℃時，幼苗體內MDA含量達到最高值，為28.39 μmol/g；在凍融階段，溫度在10 ℃時，MDA含量最低，為22.62 μmol/g。這表明在凍融脅迫下，黑麥草幼苗細胞膜系統(tǒng)受到損害，產生高活性的過氧化產物，使黑麥草幼苗體內MDA含量逐漸上升。這與宋采博等關于不同溫度對白三葉幼苗生長的影響研究結果[11]相一致。經pH值4.5酸沉降脅迫處理后，與復合脅迫處理相比，黑麥草幼苗體內MDA含量隨溫度降低而下降，下降了10.16%～4282%（P<0.05），在-2 ℃時達到最低值 17.61 μmol/g（圖3），這表明酸沉降脅迫影響黑麥草幼苗體內MDA的分泌，且隨著酸脅迫的加深MDA含量增加，直接導致葉片膜結構的損害[12]。經凍融+酸沉降復合脅迫處理后，黑麥草幼苗體內MDA含量隨溫度下降而升高，在溫度為-2 ℃時，達到最高值25.15 μmol/g（圖3）。上述分析顯示，在單一凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內MDA含量隨溫度降低而升高，但在pH值4.5的酸沉降脅迫下其體內MDA含量明顯降低。這說明酸沉降可降低黑麥草幼苗體內MDA含量，減少凍融對黑麥草幼苗的損傷，增強了黑麥草幼苗自身的抗寒性。

2.4凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內SOD活性的影響

在凍融脅迫條件下，與凍融+酸沉降復合脅迫相比，黑麥草幼苗體內SOD活性提高，在溫度為-2 ℃時，SOD活性達到最高值107.35 U/mg，提升了 37.12%（圖4）。SOD活性升高說明黑麥草自身抗寒性變強，膜傷害程度變低。SOD可有效地清除過多的自由基而抑制過氧化作用，能及時清除幼苗體內的有害物質，保護黑麥草自身不受損傷[12]。與經復合脅迫處理的幼苗相比，經pH值4.5酸沉降脅迫的幼苗體內SOD活性較高，其活性趨勢先降低，隨后升高，在10 ℃時，SOD活性達到最高值，為122.51U/mg，在溫度為4℃時，

SOD活性降到最低點，為93.88 U/mg（圖4）。這與呂家根等關于酸雨脅迫下小麥微弱延遲發(fā)光及其生理變化的研究結果[13]一致。在凍融+酸沉降復合脅迫條件下，黑麥草幼苗體內SOD活性隨溫度下降而降低，在溫度為-2 ℃時降到最低點，為78.29 U/mg（圖4）。這表明酸沉降脅迫能增強黑麥草幼苗體內SOD活性，逆境脅迫可以促進活性氧產生，加強膜脂氧化作用，平衡黑麥草體內活性氧。

2.5凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內POD活性的影響

如圖5所示，與凍融+酸沉降復合脅迫相比，在凍融脅迫條件下的黑麥草幼苗體內POD活性降低，下降了11.71%～20.67%；在融凍階段，幼苗體內POD活性隨溫度下降而升高，在-2 ℃時，達到最高值6.23 U/mg；在凍融階段，幼苗體內POD活性隨溫度升高而降低，在溫度為10 ℃時，降到最低值5.1 U/mg。本研究表明，在凍融單一脅迫下，黑麥草幼苗體內POD活性隨溫度降低逐漸升高，凍融促使黑麥草幼苗的細胞膜透性降低，促進細胞自由基積累，從而激活了黑麥草細胞內抗氧化系統(tǒng)，使POD活性逐漸增強[14]。與復合脅迫下的黑麥草幼苗體內POD活性相比，pH值4.5酸沉降脅迫下的幼苗體內POD活性隨溫度下降逐漸升高，在溫度降到 -2 ℃ 時，升到最高值 6.28 U/mg，在溫度上升到10 ℃時，POD活性下降到最低值4.68 U/mg（圖5）。這與王濤等關于模擬酸雨脅迫對菲白竹生理特性的影響研究結果[15]一致。黑麥草幼苗體內POD活性逐漸提高，說明黑麥草自身有較強的抗酸能力，對逆境的適應能力強，這與郭慧媛等關于模擬酸雨對毛竹葉片抗氧化酶活性的影響研究結果[16]一致。在凍融+酸沉降復合脅迫條件下，幼苗體內POD活性隨溫度降低而升高，在-2 ℃時，升到最高值，為6.96 U/mg；在溫度升到10 ℃時，POD活性下降，為5.49 U/mg（圖5）。以上分析表明，凍融+酸沉降復合脅迫能使黑麥草幼苗體內的POD活性含量增加。

3結論

變溫脅迫可使黑麥草積累滲透調節(jié)物質，增加了其可溶性蛋白、可溶性糖、MDA含量，SOD和POD活性也明顯提升。在酸沉降脅迫下，黑麥草幼苗體內可溶性蛋白、可溶性糖、MDA含量呈下降趨勢，SOD和POD活性提高。結果表明，黑麥草自身具有較強的抗寒性，在低溫脅迫下可以起到自我保護的作用，同時黑麥草也具有一定的抗酸性，對逆境的適應能力強。

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