雙齒圍沙蠶消化道降油細菌的分離鑒定及降油性能研究

王緒磊+陳弘昊+王斌

摘要： 從采自遼寧大連地區的雙齒圍沙蠶消化道分離得到3株能利用柴油為唯一碳源的石油降解菌，編號分別為，編號為SC11-32-2，SC11-37，SC11-38。通過形態學和16S rDNA序列比對對菌株進行鑒定，結果顯示：SC11-32-2菌株16S rDNA序列與Pseudomonas monteilii同源性為99.9%，SC11-37菌株16S rDNA序列與Vibrio alginolyticus同源性為99%，SC11-38菌株16S rDNA序列與Pseudomonas composti同源性99%。繼而測定了不同濃度（107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL）分離菌對柴油的降解率，以及加入葡萄糖后不同濃度（107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL）分離菌對柴油的降解率。結果顯示：SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為26.31%、44.52%、51.26%；SC11-37菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為7.89%、19.22%、23.36%；SC11-38菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為12.32%、27.33%、35.56%；加入終濃度為4g/L葡萄糖后，3株菌對柴油的降解率均有顯著提高，SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為87.56%、88.33%、88.62%；SC11-37菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為67.88%、69.12%、70.38%；菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為75.67%、78.35%、79.56%。

關鍵詞：雙齒圍沙蠶； 石油降解菌； 降油率

中圖分類號：Q48 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2017）03-0177-04

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.096

Abstract： In this study， 3 strains of oil-utilizing bacteria were isolated from the digestive tract of Pernereis aibuhitensis collected from DaLian， Liaoning， China through medium containing diesel oil as a sole source of carbon.， named SC11-32-2， SC11-37， SC11-38. Cellular morphological observations and molecular indentifications of 16S rDNA were used to identify strains SC11-32-2， SC11-37 and SC11-38. The results showed that strain SC11-32-2 belonged to the genus Pseudomonas monteilii， and the homology is 100%；strain SC11-37 belonged to the genus Vibrio alginolyticus， and the homology is 99%；strain SC11-32-2 belonged to the genus Pseudomonas composti， and the homology is 99%.The initial diesel oil-degrading efficiency of different inoculation quantity was detected， meanwhile the oil-degrading efficiency was studied when glucose was added. The results showed that the initial diesel oil-degrading efficiency of SC11-32-2 in the inoculation quantity of 107cfu/mL， 108cfu/mL， 109cfu/mL was 26.31%， 44.52% and 51.26%， respectively. And significantly increased to 87.56%， 88.33% and 88.62% after adding 4 g/L glucose， In the same situation， the diesel oil-degrading efficiency of SC11-37 increased from 7.89%，19.22% and 23.36% to 67.88%， 69.12% and 70.38% in three inoculation levels. The diesel oil-degrading efficiency of SC11-38 increased from 12.32%， 27.33% and 35.56% to 75.67%， 78.35% and 79.56% in three inoculation levels.

Key words： Perinereis aibuhitensis； petroleum-degrading bacteria； degradation

1 研究背景

作為近海常見的主要環境災害之一，海洋溢油污染已經給人們正常的生產生活帶來長期的影響，因此海洋溢油的生物降解也因此受到世界各國的重視。中國近年來海洋溢油污染趨勢不斷加大，對海洋生態環境帶來巨大的破壞和威脅，已經嚴重危害到我國沿海地區工農業及海洋產業的可持續發展[1]。利用微生物修復被污染環境是目前研究最多、應用最多的治理方法。自然界中目前已知的可以降解石油污染物的微生物類群多達200多種[2，3]，據報道，目前已經分離篩選出可以降解石油類污染物的主要菌群有：假單胞菌Pseudomonas[4]，不動桿菌Acinetobacter[5]，短桿菌Brevibacterium，芽孢桿菌Bacillus[6]等。通過微生物對石油污染物的生物降解的菌源大多分離自海洋沉積物、海水、海冰、土壤樣品[7-10]，而對于耐污染的無脊椎動物消化道附著降油微生物的研究目前還未見報道。雙齒圍沙蠶（Pernereis aibuhitensis）是重要的海洋沉積食性無脊椎動物，廣泛的分布于中國沿海灘涂和河口沉積物中。雙齒圍沙蠶可以蓄積環境中的有機污染物并通過自身的生物轉化作用分解和代謝污染物，是海洋沉積環境早期污染生態風險評價的指示生物和生態毒理學研究中重要的模式生物[11-13]。分離結果顯示，無脊椎動物中附著微生物中具有生物活性菌株的分離比率高于海水及沉積物的分離比率[14]，因此通過對雙齒圍沙蠶消化道附著微生物中降油菌株的分離篩選可以提供新的優良降油菌源。本研究通過分離雙齒圍沙蠶消化道附著微生物，繼而從中篩選出具有降解石油污染物能力的菌株，為制備用于海洋石油污染修復的復合菌劑提供菌種，同時也為探索以沙蠶為載體的定植降油細菌用于海洋環境中石油污染的生物修復奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 雙齒圍沙蠶樣品及培養基

實驗所用雙齒圍沙蠶采自遼寧大連金州沿海潮間帶，體重約4g，采樣后暫養于無菌海水中。菌株初篩使用2216E固體培養基，菌株復篩使用柴油平板培養基，測定菌株柴油降解率使用基礎無機鹽培養基[15]。

2216E培養基：蛋白胨5g、酵母膏1g、瓊脂粉20g、FePHO4 0.01g、陳海水1000ml，pH7.6-7.8，121℃高壓滅菌20min。

基礎無機鹽培養基：NaCl 20g、KH2PO4 1g、K2HPO4 0.5g、NH4Cl 0.5g、MgSO4 0.5g、KCl 0.1g、FeSO4 0.01g、CaCl2 0.002g、純水1000mL，pH7.2，121℃高壓滅菌20min。

柴油平板培養基：基礎無機鹽培養基1000mL、瓊脂粉20g、吐溫80mL、0號柴油10mL，pH7.2，121℃高壓滅菌20min。

斜面保種培養基（2216E）：蛋白胨5g，酵母膏1g，瓊脂粉15g，FePHO4 0.01g，陳海水1000ml，pH7.6-7.8，121℃高壓滅菌20min。

2.2 石油降解細的篩選分離

將采集到的雙齒圍沙蠶樣品在無菌海水中暫養24h，使其充分排盡腸道內容物后，然后放入10%乙醇溶液中進行麻醉。將麻醉后的沙蠶放入超凈工作臺解剖盤中，用75%的乙醇對其體表進行消毒，使用滅菌海水沖洗后，用無菌剪刀、解剖刀、鑷子取出雙齒圍沙蠶消化道，將取出的雙齒圍沙蠶消化道樣品置于5mL滅菌離心管中，加入2mL無菌海水并用勻漿器勻漿，對勻漿進行梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），取各稀釋梯度樣品各100?L分別涂布于2216E平板上，25℃培養1-2天，根據不同菌落形態挑菌行純化，每株菌純化3代后保種于2216E斜面用作初篩降油菌株。將沙蠶消化道分離菌分別用滴注法接種到以柴油為唯一碳源的平板培養基上，25℃恒溫培養箱培養2-3天。待平板上長出清晰菌苔，從中挑選出生長狀況良好的菌株作為石油降解初篩菌株進行后續實驗。

2.3 16S rDNA序列的擴增、測序及系統發育樹的構建

使用上海生工的DNA Kit提取分離菌株總DNA。采用細菌16S r DNA基因 V4+V5區的通用引物進行PCR擴增，PCR擴增產物樣品送上海生工進行測序。將測序所得各菌株16SrDNA序列采用鄰接法使用MEGA 5.05軟件構建系統進化樹，并通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數為1000次。

2.4 細菌原始降油率測定

將篩選到的菌株用2216E斜面培養基培養24小時后，用無菌生理鹽水洗脫，配制成菌懸液（約2×109 cfu/m L），用血球計數板計數后梯度稀釋，選擇菌數為107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL的菌懸液以100?L接菌量接種于100 mL以柴油為唯一碳源的MMC培養基中，150 r/min，25℃恒溫搖床培養7天，以不接種菌液的培養基作為對照組，每組設置三個平行。通過石油醚萃取剩余柴油和紫外分光光度法測定221nm的吸光值（OD221nm）計算降解率。根據下面的公式計算出降解率：降解率（D）=（A0-Ai）/A0，其中D為柴油降解率，A0為對照組柴油吸光值，Ai為實驗組剩余柴油吸光值。

2.5 測定葡萄糖對石油降解菌降油率的影響

分別按107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL3個濃度將實驗菌接種于葡萄糖終濃度為4g/L的MMC培養基，接種量為100?L，不接種菌液的培養基作為對照組，每種接菌量設置三組平行實驗。將接種菌液的三角燒瓶置于150 r/min ，25℃恒溫搖床中培養7天，以2.4所述方法測定柴油降解率，比較添加葡萄糖情況下菌株對柴油降解率的變化。

3 結果

3.1 石油降解菌的篩選

實驗共分離8株不同菌落形態的菌株，其中3株菌可在以柴油為唯一碳源的平板培養基中生長，編號分別為SC11-32-2，SC11-37，SC11-38。25℃條件下在2216E平板上培養24h后，SC11-32-2菌落形態呈乳白色圓形，邊緣齊整，不透明，直徑1.5-2.0mm，經革蘭氏染色該菌株鏡下為革蘭氏陰性菌。SC11-37菌株菌落形態呈淡棕色，菌落形狀不規則，不透明，直徑1.0mm，革蘭氏染色后鏡下顯示為革蘭氏陰性菌。SC11-38菌株菌落形態呈乳白色圓形，邊緣齊整，不透明，直徑1.0mm，革蘭氏染色后鏡下顯示為革蘭氏陰性菌。

3.2 菌株16S rDNA序列及系統發育樹

將通過PCR擴增出的3株菌的16SrDNA序列送上海生工測序，測序結果經NCBI數據庫Blast后發現SC11-32-2菌株16SrDNA序列與Pseudomonas monteilii同源性為99.9%，SC11-37菌株16S rDNA序列與Vibrio alginolyticus同源性為99%，SC11-38菌株16SrDNA序列與Pseudomonas composti同源性為99%。通過Mega5.05 軟件進行多序列比對然后采用鄰接法構建系統發育樹，結果如圖1，通過下圖可以看出，菌株SC11-32-2與 Pseudomonas monteilii 聚為一枝；菌株SC11-37 Vibrio alginolyticus與聚為一枝；菌株SC11-38與Pseudomonas composti聚為一枝。

3.3 菌株不同接菌量初始降解率的測定

SC11-32-2、SC11-37及SC11-38菌株不同接種量條件下初始降解率如圖2所示。由圖可見，隨著接菌量的增加，3株菌對柴油的降解率均由不同程度升高。其中SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為26.31%、44.52%、51.26%；SC11-37菌在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為7.89%、19.22%、23.36%；SC11-38菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為12.32%、27.33%、35.56%。使用SPSS軟件進行差異性計算，結果顯示接種量為107cfu/mL 時，柴油降解率與108cfu/mL、109cfu/mL柴油解率差異顯著（P<0.05），接種量在108cfu/mL、109cfu/mL時降解差異不顯著（P>0.05）。

3.4 添加葡萄糖對菌株降油率的影響

在以柴油為唯一碳源的MMC培養基中加入終濃度為4g/L的葡萄糖后，不同接菌量實驗組對柴油降解率均有大幅度提升，結果如圖3、圖4、圖5所示，其中SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為87.56%、88.33%、88.62%；SC11-37菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為67.88%、69.12%、70.38%；菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接種量條件下的降油率分別為75.67%、78.35%、79.56。在添加終濃度為4g/L的葡萄糖后，相同接菌量實驗組3菌株相較不添加葡萄糖實驗組對柴油降解率均有極顯著提升（P<0.01）。而在添加終濃度為4g/L的葡萄糖的實驗組，3菌株不同接菌量對柴油降解率均無顯著性差異（P>0.05）。

4 討論

通過以柴油為唯一碳源的平板培養基初篩得到3株能夠利用柴油的菌株，編號為SC11-32-2，SC11-37，SC11-38，經鑒定3株菌分別屬于Pseudomonas monteilii，Vibrio alginolyticus，Pseudomonas composti菌屬。3株菌的原始降油率均隨接菌濃度的升高而升高，其中SC11-32-2對柴油的降解率高于SC11-37和SC11-38。目前，關于Pseudomonas monteilii的報道主要是關于其胞外分泌酯酶[16]、該菌株對花草煙葉病毒的廣譜抑制[17]、對硝基酚的降解作用[18]以及對植物致病菌的拮抗作用[19]，而有關該菌株對石油的降解作用還未見報道。在今后的研究中，可以通過在沙蠶養殖過程中，將降油效果優秀的SC11-32-2菌株定植到沙蠶消化道，構建降油菌的沙蠶-降油菌載體，再將其投放到石油污染土壤或灘涂中以達到原位修復的目的；也可以以SC1-32-2菌株作為優良菌源開發微生物降油菌劑。

SC11-32-2，SC11-37和SC1-38菌株在加入終濃度為4 g/L葡萄糖后對柴油的降解率均有極顯著提高，可能是這3株菌存在葡萄糖與柴油的共代謝作用。微生物共代謝作用是由Jensen[20]提出，是指微生物從生長基質中獲取全部或大部分的碳源和能源從而改變一些難降解的有機物的化學結構，它具有縮短微生物適應期和繁殖期的優勢[21]。近年來，微生物共代謝的研究不斷深入并廣泛應用于污水治理、環境修復等領域難降解有機污染物的生物降解[22-24]。陳芳艷[25]等在研究外加碳源對尖鐮孢菌對蒽降解的影響中發現當葡萄糖添加濃度為5 mg/L時，尖鐮孢菌對蒽的降解率達到95%，顯著高于其原始降解率64.8%；袁芳[26]在研究2，4-二硝基甲苯的共代謝時發現當葡萄糖與2，4-二硝基甲苯的比例達到4：1時，菌株對2，4-二硝基甲苯的降解率達到75%，顯著高于其原始降解率35%。本研究中SC11-31-2，SC11-37和SC1-38菌株來自雙齒圍沙蠶的消化道，在添加葡萄糖時對柴油的降解率顯著提高，可為今后使用菌株進行生物修復工作時提供指導和科學依據。

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收稿日期：2017-05-18

基金項目：海洋公益性行業專項項目 （ 201305002，201305043 ）

作者簡介：王緒磊（1991-），男，碩士，主要研究海洋微生物在生物修復中的應用。