Cd脅迫對水稻葉NR活性、GS活性和可溶性蛋白質含量的影響

謝斯斯+盧維盛+吳道銘+鐘輝祥+陳遠+陳偉彬+黃家歡+陳貴然+張慧敏+吳祝拓

摘要：通過盆栽試驗，以秈稻培雜泰豐和粳稻日本晴為供試水稻品種，研究了Cd脅迫對水稻NR（硝酸還原酶）活性、GS（谷氨酰胺合成酶）活性和可溶性蛋白質含量的影響。結果表明，Cd脅迫對水稻葉GS活性和 NR活性均表現為低促高抑或抑制作用，在不同時期和不同品種間表現不同。隨環境（土壤）鎘濃度的上升，日本晴葉可溶性蛋白質含量呈現先上升后下降的趨勢，而培雜泰豐則保持上升趨勢。培雜泰豐比日本晴具有更高的Cd耐受能力。

關鍵詞：水稻；Cd脅迫；NR；GS；可溶性蛋白質

中圖分類號：S161.2+1 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2017）03-0201-04

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.110

Abstract： Pot experiment was carried out to study the effect of cadmium（Cd） stress on NR activity ，GS activity and soluble protein content in rice leafes. The tested rice varieties were Peiza Taifeng and Nipponbare. The results showed that NR activity and GS activity all tended to promote weakly and inhibited with increase of Cd concentration. With the Cd application， the content of soluble protein in Nipponbare leafes firstly increased and then decreased， while Peizataifeng was to maintain an upward trend. Peizataifeng had higher Cd tolerance than Nipponbare.

Key Words： rice；N-Cd；NR；GS；soluble protein

近年來，隨著工農業生產和城市化的發展，農田土壤中重金屬污染問題日益突出，進而影響到我國的稻米質量安全[1]。水稻作為我國最重要的糧食作物之一，對Cd具有較強的吸收和耐受能力[2]，存在稻米Cd超標風險。小劑量鎘可提高或加速某些生理生化反應，而大劑量則對植物產生抑制和毒害，有人把此現象解釋為鎘在低濃度時對植物有一定的“刺激作用” [3]。但重金屬不論其濃度如何，對植物的生理生化過程都是有害的，只不過植物對重金屬的反應是一個過程中的兩種作用的復合效應[4]。Cd可以通過影響游離氨基酸、可溶性蛋白含量以及植物體內的酶系統而擾亂植物的各種生理生化代謝過程[5]，Cd對水稻毒害主要表現為氧化損傷，影響植物的抗氧化系統和光合作用、呼吸作用等生理代謝過程[6]。鎘脅迫造成植物體內一些大量和微量元素吸收與分配發生混亂，其中氮代謝失調是植物鎘毒害的重要原因，氮素代謝作為植物生長發育中一個重要的營養代謝途徑，其多種中間代謝產物或含氮有機物對緩解環境不良因子起著重要的作用，鎘脅迫環境下植物保持正常的氮代謝是它對鎘毒害具有一定耐性的表現[7]。本試驗選用秈稻培雜泰豐和粳稻日本晴為供試水稻品種，采用土培方法，研究了N-Cd交互處理對水稻氮代謝酶活性和可溶性蛋白質含量的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為培雜泰豐（秈稻）和日本晴（粳稻），種子由華南農業大學農學院提供。盆栽土壤取自華南農業大學試驗田的農田水稻土，土壤自然風干后，過5mm篩。土壤基本理化性狀見表1，具體分析方法參見《土壤農業化學分析方法》[8]。

1.2 試驗設計

盆栽試驗在華南農業大學溫室內進行。設4個Cd水平0.0、1.0、3.0和5.0 mg·kg-1土（以純Cd計，CdCl2·2.5H2O為Cd源），設2個氮（尿素為氮源）水平N100、N200 mg·kg-1土（以純N計）。按照常規進行水分管理。

1.3 測定

分別于抽穗期和成熟期取樣測定。采取葉鮮樣，將洗凈擦干的水稻新鮮綠葉，混勻后稱取約10g剪碎，于-20℃冰箱中保存備用，用于酶活性測定。

1.3.1 硝酸還原酶（nitrate-reductase，NR）活性測定

0.5g水稻鮮葉+7.5ml提取緩沖液（1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol·L-1 pH8.7的磷酸緩沖溶液），研磨成勻漿，轉移到離心管中于4℃、4000 r·min-1下離心15min，上清液即為粗酶提取液。0.4ml粗酶提取液+1.2ml 0.1 mol·L-1 KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混勻（對照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1 mol·L-1 pH 7.5磷酸緩沖液代替），在25℃水浴中保溫30min。保溫結束后立即加入1ml磺胺溶液終止酶反應，再加1ml 0.2% a-萘胺溶液，顯色反應15min后于4000 r·min-1下離心5min，取上清液在540nm下比色測定吸光度。根據回歸方程計算NR活性，單位表述為μg ·g-1·h-1[9]。

1.3.2 谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性測定

1g水稻鮮葉+8ml pH7.2磷酸提取液（0.146g EDTA·L-1提取液），研磨成勻漿，轉移到離心管中于4℃、18000 r·min-1下離心20min，上清液即為粗酶提取液。酶粗液1ml+0.6ml咪唑-鹽酸緩沖液（0.25mol·L-1，pH7.0）+0.4ml谷氨酸鈉溶液（0.30mol·L-1，pH7.0）+0.4ml ATP-Na溶液（30mmol·L-1，pH7.0）+0.2ml MgS04溶液（0.5 mol·L-1）。反應液在25℃水浴中保溫5 min后，加入0.2ml羥胺試劑開始反應，25℃水浴中保溫15 min后，立即加入1ml 酸性FeCl3試劑終止反應?；旌弦涸?000 r·min-1離心15min，測定上清液在540nm處的光密度?？偦钚詾椋好靠缩r樣酶粗液在15min的反應時間內消光值的變化量，單位表述為△OD·g-1·min-1[10]。

1.3.3 可溶性蛋白質含量測定

0.2g水稻鮮葉+5ml磷酸提取液（pH7.0），研磨成勻漿，轉移到離心管中于4000 r·min-1下離心20min，上清液倒入10ml容量瓶中，定容至刻度。取 0.1ml 樣品提取液+0.9ml蒸餾水+ 5ml考馬斯亮藍G-250混勻，放置5min后在595nm下比色。根據回歸方程計算蛋白質含量mg/g[9]。

1.4數據處理

試驗中數據用Excel和SPSS進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 水稻不同時期葉谷氨酰胺合成酶（GS）活性

從圖1和圖2可知，從抽穗期到成熟期，無Cd處理的水稻葉GS活性有所上升，而有Cd處理的葉GS活性明顯下降，Cd脅迫使水稻后期氮素同化能力下降。抽穗期，隨著Cd處理濃度上升，水稻葉GS活性呈現先上升后下降的趨勢，但兩水稻品種葉GS活性對Cd處理的反應不同，日本晴是在Cd 1.0 mg·kg-1土時升至最高后下降，而培雜泰豐是在Cd 3.0 mg·kg-1土時升至最高后有所下降。成熟期，Cd處理對水稻葉GS活性主要表現為抑制作用，尤其對培雜泰豐。

2.2 水稻不同時期葉硝酸還原酶（NR）活性

分析圖3和圖4可知，抽穗期兩品種水稻葉NR活性無明顯差異，但成熟期培雜泰豐葉NR活性顯著高于日本晴。從抽穗期到成熟期，水稻葉NR活性顯著下降，有Cd處理的下降幅度高于無Cd處理的。Cd處理對日本晴葉NR活性表現為抑制作用，而對培雜泰豐則表現為明顯的低促高抑。

2.3 水稻不同時期葉可溶性蛋白質含量變化

由圖5和圖6可知，從抽穗期到成熟期，兩品種水稻葉可溶性蛋白質含量明顯減少。隨Cd處理濃度的上升，日本晴葉可溶性蛋白質含量呈現先上升后下降的趨勢，而培雜泰豐則保持上升趨勢。

2.4 水稻葉GS活性、NR活性和可溶性蛋白質含量的方差分析

由表2可知，水稻葉NR活性和可溶性蛋白質含量與因素間存在顯著線性相關性。水稻葉GS活性、NR活性和可溶性蛋白質含量隨時期的變化而明顯變化；Cd處理對水稻葉可溶性蛋白質含量具顯著影響，培雜泰豐NR活性對Cd處理的響應顯著高于日本晴，而日本晴GS活性對Cd處理的響應顯著高于培雜泰豐的；N施用量對水稻GS活性和可溶性蛋白質含量影響顯著，尤其對日本晴。

3 討論與結論

在脅迫條件下，必需元素尤其是硝酸鹽的變化，能引起基因表達和酶活性的變化，在一些植物中，鎘對硝酸鹽及其同化都產生影響[11]。谷氨酰胺合成酶（GS）是處于氮代謝中心的多功能酶，參與多種氮代謝的調節，其活性的高低可以反映氮素同化能力的強弱 [12]。硝酸還原酶（NR）是植物同化硝酸鹽的限速酶，以硝酸還原酶為中心的調控系統是植物最原始、最基本的氮代謝調控系統，在水稻氮素代謝過程中起關鍵作用[13]。有研究證實，細胞中可溶性蛋白質含量的增加，一方面可與Cd2+ 形成鎘結合蛋白（Cd-BP），Cd-Bp的形成限制了自由態Cd2+的存在，減輕了鎘對植物的毒害；另一方面可提高功能蛋白的數量，增加細胞滲透勢，有助于維持細胞正常代謝，提高植物的抗逆性[14]。鎘脅迫下，水稻幼苗葉片可溶性蛋白含量、脯氨酸含量及硝酸還原酶活性明顯增加[15]。本研究表明，Cd處理對水稻葉可溶性蛋白質含量具顯著影響，培雜泰豐NR活性對Cd處理的響應顯著高于日本晴，而日本晴GS活性對Cd處理的響應顯著高于培雜泰豐。從抽穗期到成熟期，無Cd處理的水稻葉GS活性有所上升，而有Cd處理的葉GS活性下降；葉NR活性明顯下降，但有Cd處理的下降幅度高于無Cd處理。Cd處理對水稻葉GS活性和 NR活性均表現為低促高抑或抑制作用，具體表現與時期和品種有關，對抽穗期水稻葉GS活性表現為明顯的低促高抑，而對成熟期水稻葉GS活性則主要表現為抑制作用；對日本晴葉NR活性主要表現為抑制作用，而對培雜泰豐則表現為低促高抑?？偟膩碚f，培雜泰豐葉GS活性和 NR活性對Cd的耐受能力高于日本晴。隨環境（土壤）鎘濃度的上升，日本晴葉可溶性蛋白質含量呈現先上升后下降的趨勢，而培雜泰豐則保持上升趨勢。培雜泰豐比日本晴具有更高的Cd耐受能力。

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收稿日期：2017-05-12

作者簡介：謝斯斯（1984-），女，碩士研究生，中級環保工程師，研究方向為環境保護。