卵巢腫塊中超聲造影參數圖像處理軟件的DVP表現及與VEGF和HIF-1a同步相關研究

仲躋鳳，孟慶欣

(1.南京中醫藥大學附屬海安縣中醫院 超聲科，江蘇 南通226600；2.南京軍區總醫院 超聲科)

卵巢腫塊中超聲造影參數圖像處理軟件的DVP表現及與VEGF和HIF-1a同步相關研究

仲躋鳳1，孟慶欣2

(1.南京中醫藥大學附屬海安縣中醫院 超聲科，江蘇 南通226600；2.南京軍區總醫院 超聲科)

對于實質性的腫瘤微環境來說，缺氧狀態屬于一種非常常見的基本特征[1]。因為惡性腫瘤增殖生長的速度過于迅速，和腫瘤細胞中的血管不成比例，造成局部組織嚴重缺氧[2]。腫瘤可通過多種方式適應缺氧微環境，其中最重要的代償機制和腫瘤血管的誘導形成密切關聯[3，4]。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)屬于一種非常重要的生長因子，主要作用是對惡性腫瘤血管的形成產生刺激作用，與腫瘤的發生發展密切相關。在缺氧情況下，機體組織的許多因子都會做出應激反應，在這個過程中起中心調節作用的因子就是缺氧誘導因子(Hypoxia Inducibie Factor,HIF-1a)。HIF-1a可促進腫瘤生長、侵襲及轉移[5，6]。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象：2010年2月至2016年2月在本院及在南京軍區總醫院學習期間常規超聲發現卵巢包塊的患者50例，年齡24-70(44±12)歲。所有患者于術前1周內行盆腔超聲造影檢查，初步判定卵巢腫塊的性質，再結合手術病理結果分析卵巢良惡性腫塊不同的超聲造影特征。所有患者在檢查前簽署知情同意書，對無臨床指征者不以研究為理由進行組織標本采集。排除孕期或哺乳期婦女、術前行介入治療或化療、有心臟病史、近期血栓史及對造影劑中任何成分過敏者。50例病例分別為：良性腫塊28例，其中漿液性囊腺瘤8例，粘液型囊腺瘤6例，子宮內膜異位囊腫2例，成熟畸胎瘤3例，炎性包裹性積液2例，卵泡膜細胞瘤1例，卵巢結核1例，出血性黃體囊腫2例，卵巢纖維瘤3例；惡性22例，其中漿液性囊性瘤9例，粘液性囊腺瘤5例，未成熟畸胎瘤2例，大網膜炎性纖維肉瘤2例，轉移性瘤3例，惡化卵泡膜瘤1例。

超聲診斷儀：VolusuanE8 ，探頭C1-5，頻率3.5-5.0 MHz。

超聲造影采用1.0造影分析軟件。造影劑Sonovue。試劑：鼠抗人VEGF、HIF-Ia單克隆抗體由美國Abcom公司提供。

1.2 方法

超聲造影檢查：患者取仰臥位，檢查過程中保持體位不變并勻速呼吸。每個病例由同一超聲醫師在相同條件下、同一臺超聲診斷儀完成。造影前所有患者均簽署知情同意書。根據上升時間、達峰時間及平均跨越時間等時間相關性指標的參數成像圖特征，提出參數成像診斷法：以顏色邊界不清晰、顏色過渡紊亂，“點狀”分布者計1分；顏色邊界清晰，顏色過度均勻，“片狀”分布者計0分。對每個病例的這3個參數成像圖分別進行計分，相加得出總分，以總分≦1分歸為良性組，總分≧2分歸為惡性組，將病理診斷作為金標準得出配對計數資料，計算兩種診斷方法的結果一致性。利用參數成像法計算卵巢腫塊的敏感性、特異性等。

免疫組織化學染色檢測卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達：手術中的使用的標本注意使用10%的甲醛液進行固定，時間為1天，將該標本送南京軍區總院病理科檢測。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 造影前后卵巢良惡性腫瘤聲像圖特征

良性腫塊大多表現為囊性為主，邊界清楚，少數為實性或實性為主，常規超聲測量腫塊直徑結果為良性組3.9-13.2 cm，平均(7.2±3.4)cm；惡性腫塊多表現為混合性包塊或實性包塊，邊界不規則，直徑4.0-12.9 cm，平均(8.5±2.9)cm，造影后良性4.2-15.2 cm，平均(7.4±3.6)cm，造影后腫塊直徑較造影前無明顯增大，差異無統計學差異(P=0.398)；對于惡性組來說，大約是4.5-13.2 cm，平均直徑是(9.7±3.0)cm。由此可知造影之前的直徑要遠小于造影后的直徑，兩者之間的差異具有統計學意義(P=0.006)。

2.2 卵巢良惡性腫塊造影前后病灶內血流顯像情況

造影前后卵巢良惡性腫塊的血管數目、形態及分布明顯不同。卵巢良性腫塊顯示瘤內無灌注或均勻性增強，多數從周邊向內部灌注，血管多分布于腫塊的周邊，形態規則，偶見稀疏分支，但光滑，走行較直，血管之間無分流；而惡性腫塊在造影后顯示瘤體不均勻性增強，多數從中央向周邊灌注，血管數目較良性腫塊明顯增多，分布于腫塊內外，外圍血管粗大、扭曲、走向不規則，呈樹枝狀、蟹足狀伸入瘤內，瘤內血管呈繁星點狀、團簇狀。

對50例卵巢腫塊用SonoLiver超聲造影參數圖像處理分析軟件進行脫機分析，良性腫塊中24例(86%)顯示內部以藍色為主的低增強(圖1)，其中包括4例內部無增強(2例炎性包裹性積液顯示內部無增多，2例子宮內膜異位囊腫顯示內部無增強，但囊壁和分隔見造影增強顯像)；4例顯示內部以紅色為主的高增強(14%)，分別是畸胎瘤2例，卵巢纖維瘤2例；惡性腫塊中15例(68%)顯示內部以紅色為主的高增強(圖1)，7例顯示內部以藍色為主的低增強(32%)。兩組比較差異有統計學意義(χ2=15.190，P<0.01)。

圖1 卵巢漿液性囊腺瘤、上皮性癌超聲造影圖像

2.3 TIC、DVP曲線分析

卵巢良性腫塊時間-強度曲線(TIC)多表現為“緩升緩降”，波峰圓鈍，上升支與下降支較平滑，廓清時間較長；惡性腫塊的TIC多表現為“速升速降”，波峰尖銳，上升支下降支均陡直，較周圍正常組織提前達峰。動態血管模式(DVP)曲線的特征：良性組中的23例(79%)DVP曲線在造影全過程全部時段保持在基線之下(圖2)，5例在基線之上(18%)，這5例分別是畸胎瘤2例，纖維瘤1例，卵巢黃體囊腫出血2例；惡性組中有15例(68%)DVP曲線在造影全過程全部時段保持在基線之上(圖2)，6例(27%)在灌注其和廓清早期位于基線之上，廓清中晚期降至基線之下，1例(5%)在造影全過程全部時段保持在基線之下。

圖2 卵巢漿液性囊腺瘤、上皮性癌動態血管模式曲線

2.4 卵巢良惡性腫塊超聲造影TIC定量參數比較

卵巢腫塊經超聲造影圖像呈隨時間變化而出現灌注強弱、消退的變化規律。造影劑達峰強度惡性腫瘤顯著高于良性腫瘤(P=0.000)，達峰時間及平均跨越時間惡性組短于良性組(P<0.05)，上升時間雖惡性短于良性，但無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 卵巢良惡性腫塊的TIC各參數比較

2.5 卵巢良惡性腫塊中VEGF和HIF-1a的變動情況及相關性

VEGF主要表達于卵巢癌細胞的胞質或胞膜、腫瘤間質血管內皮細胞及少量炎性細胞，胞質中的表達最強。VEGF在良性卵巢腫塊組織陽性表達率為22%(4/18)，其中中表達(++)，低表達(+)；但是惡性卵巢腫塊組織中的陽性表達率是72.7%(16/22)，并且多為中表達(++)，高表達(+++)，低表達(+)。兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 卵巢良惡性腫塊中VEGF的表達情況

HIF-1a主要表達于卵巢癌細胞的胞質，胞核及間質的血管內皮細胞，胞質最多見，見圖3。HIF-1a在良性卵巢腫塊組織的陽性表達率為10.7%(3/28)，均表示低表達(+)；在惡性卵巢腫塊組織的陽性表達率為69.2%(15/22)，多為高表達(+++)，中表達(++)。兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 卵巢良惡性腫塊中HIF-1a的表達情況

對于22例卵巢惡性腫塊組織來說，大約有21例表現為HIF-1a和VEGF具有一致性，并且同時表現為陽性的有15例；兩者同時表現為陰性的有6例；VEGF陽性表達但是HIF-1a陰性表達的只有1例。經Spearman相關分析，卵巢惡性腫塊組織仲HIF-1a表達與VEGF表達之間呈明顯正相關(r=0.791，P<0.05)，見表4。

表4 卵巢惡性腫塊中VEGF/HIF-1a表達的相關性

超聲造影定量參數達峰強度與卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達呈明顯的正相關，P均小于0.05。上升時間、達峰時間、平均跨越時間和卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達呈明顯的負相關，P均小于0.05，見表5。

表5 卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達與超聲造影定量參數的相關性(r值)

3 討論

常規的超聲檢查不能快速檢測低速的腫瘤血管，但超聲造影則可以。超聲造影的作用主要是通過超聲造影劑微泡在血管組織中利用相關的軌跡及造影增強達峰后腫瘤內微血管的分布圖像，可觀察到70 μm左右小血管，獲得關于毛細血管的相關信息，也就是說組織內部的血供問題[7-10]，這樣可以更清楚地獲得腫瘤血管的形態、走行、分布位置以及所有腫瘤內部的血管情況等。

SonoLiver超聲造影定量分析軟件用顏色深淺反應目標組織內的造影劑灌注情況。本研究的良性腫瘤中有86%顯示為以藍色為主的低增強，惡性腫瘤中68%顯示為以紅色為主的高增強，直觀的反映了良惡性腫塊中的血管分布和血流灌注情況。而良性腫瘤中2例成熟畸胎瘤病檢結果含有伴甲狀腺成分和神經膠質成分，血流豐富，因此顯示為紅色為主的高增強；2例卵巢纖維瘤，超聲造影顯示病灶內造影劑呈絮狀慢慢充盈，較稀疏，也顯示為紅色為主的高增強。而惡性腫瘤以藍色為主的低增強可能與腫瘤的大片壞死有關。

本研究使用動態血管模式曲線是標準化時間-強度曲線，是TIC的進一步升華，研究病灶區與參考區的強度差隨時間變化的過程，反映強度差值的變化過程。卵巢惡性腫瘤TIC表現為“速升速降”、卵巢良性腫瘤TIC表現為“緩升緩降”。本次研究的22例惡性病灶中，有6例DVP曲線表現為灌注期以及廓清早期等都位于基線以上，但是廓清中晚期下降到基線之下，這樣的結果表明廓清中期和晚期的病灶內部的造影劑強度要遠遠低于周圍的正常組織的造影劑強度，進而可以間接地反映出惡性病灶內部的造影劑消失的速度要遠遠大于正常組織。造影劑達峰強度惡性腫瘤顯著高于良性腫瘤(P=0.000)，反映了惡性腫瘤血管豐富，進入腫瘤血管床的微泡總數量明顯多于良性腫瘤；達峰時間及平均跨越時間惡性腫塊短于良性腫塊(P<0.05)，說明惡性腫瘤新生血管數目增多，血管壁不完整，存在大量的動靜脈短路和血管環。而上升時間惡性短于良性，但二者無顯著性差異，可能與本研究樣本量小有關。

這里所說的腫瘤血管生成屬于一個非常復雜的過程，在一系列影響腫瘤血管生成的因子中，VEGF、HIF-1a是刺激腫瘤血管形成的重要因子、與腫瘤的發生發展密切相關。VEGF的主要作用是能夠增強血管的通透性，然后直接對血管內皮細胞的轉移和增殖分化產生刺激，進而對血管的構建和生長產生促進作用。HIF-1a屬于一種氨特異性感受器，主要來源于哺乳動物體內，并且在缺氧的狀態下對信號的轉導具有非常重要的作用。本次研究主要采用的是免疫化的方法，然后對卵巢良惡性腫瘤中的VEGF、HIF-1a因子的表達情況進行及時的檢測，結果顯示VEGF在卵巢良性腫塊組織陽性表達率分別為14.3%(4/28)，均為中低表達；在卵巢惡性腫塊組織的陽性表達率為72.7%(16/22)，多為中高表達；HIF-1a在良性良性腫塊組織的陽性表達率為10.7%(3/28)，且均為低表達；在惡性卵巢腫塊組織的陽性表達率為68.2%(15/22)，多為中高表達。HIF-1a蛋白表達與VEGF水平呈顯著性相關。這與前人的研究結果一致，提示VEGF、HIF-1a在腫瘤的發生發展中有重要的作用，HIF-1a能夠在基因水平上對VEGF的表達產生調控作用，這樣可以加快腫瘤的生長速度。腫瘤細胞不斷增生，但是血管生長相對不足引起新生腫瘤細胞局部出現缺氧的情況，缺氧又可以反饋性的對VEGF表達產生影響，進而促進血管增生，最終為腫瘤的進一步生長提供必要條件[11]。

本研究通過對卵巢腫塊的超聲造影動態血管模式表現、定量參數與血管生成因子VEGF、HIF-1a表達的相關性研究發展，達峰強度與卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達呈明顯的正相關；腫瘤血管內的血流灌注及血流量明顯增加，這表示卵巢腫塊的VEGF、HIF-1a表達越強，卵巢腫塊內新生血管數目越多，造影時進入血管床的微泡流量越大，而達峰強度反映了某一時間進入腫瘤血管床的最大微泡數量，說明了超聲造影達峰強度可間接反映腫瘤的血管生成情況。上升時間、達峰時間、平均跨越時間和卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達呈明顯的負相關，這表示卵巢腫塊的VEGF、HIF-1a表達越強，血液與組織液之間的交換面積越大，造影時血流灌注量越大，微泡流速越大，故超聲造影時間相關性指標就越短。

綜上所述，本研究術前利用SonoLiver超聲造影定量分析，從影像學宏觀評價腫瘤血管灌注狀態，術后從免疫組化的分子學微觀評價腫瘤血管生成狀態。雖然免疫組化檢測腫瘤是目前評價腫瘤血管生成最常用的方法，但它通過活檢或術后取得標本，是有創檢查，而且術后的檢查并不能達到早期診斷的目的。而造影技術作為一種新型的影像學檢查技術，以腫瘤內部血管特征為病理基礎，實時觀察病變區造影劑灌注的全過程，在腫塊的定性診斷中頗有發展[12，13]。具有無創、安全、快捷、重復性好，因此超聲造影彌補了免疫組化有創、術后評價的缺點，為卵巢癌的早期診斷提供依據。

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1007-4287(2017)06-1046-05

仲躋風，女，副主任醫師，超聲科主任，研究方向：婦科疾病的超聲診斷，各種介入性治療。

2016-10-12)