鮑曼不動桿菌生物被膜與外膜蛋白基因caro關系的研究

趙玉杰，馮雁京，劉 原*，和 平，張立然，楊 妮，敬 蓉，馬淑珍，劉聰蕊

(1.西安交通大學第二附屬醫院 呼吸內科；2.西安交通大學第二附屬醫院 重癥醫學科；3.西安交通大學第二附屬醫院 急診科，陜西 西安710004)

鮑曼不動桿菌生物被膜與外膜蛋白基因caro關系的研究

趙玉杰1，2，馮雁京1，劉 原1*，和 平1，張立然1，楊 妮3，敬 蓉1，馬淑珍1，劉聰蕊1

(1.西安交通大學第二附屬醫院 呼吸內科；2.西安交通大學第二附屬醫院 重癥醫學科；3.西安交通大學第二附屬醫院 急診科，陜西 西安710004)

目的 研究鮑曼不動桿菌生物被膜形成與外膜蛋白基因caro表達的關系。方法 結晶紫染色法檢測鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力，采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)比較臨床分離鮑曼不動桿菌在生物被膜形成的不同階段外膜蛋白基因caro表達水平。結果 66.13%的臨床分離鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力陽性；隨著生物被膜形成的成熟，外膜蛋白基因caro的表達水平下調。結論 臨床分離鮑曼不動桿菌生物被膜形成與外膜蛋白系統密切相關。

鮑曼不動桿菌；生物被膜；外膜蛋白

(ChinJLabDiagn,2017,21:1060)

鮑曼不動桿菌是一種需氧非發酵的革蘭陰性條件致病菌，易引起患者呼吸道、泌尿道、血液、傷口等感染的發生[1]。由于臨床上各類抗生素的廣泛使用所產生的選擇性壓力，鮑曼不動桿菌的耐藥形勢日益嚴峻[2]。目前有研究表明，鮑曼不動桿菌的致病力和耐藥性與生物膜的形成有關[3]。鮑曼不動桿菌的生物被膜形成與金屬離子、質粒、整合子等基因以及外膜蛋白表達水平有關[4]。本實驗比較鮑曼不動桿菌在生物被膜形成的不同階段，外膜蛋白基因caro的mRNA表達量變化，以期為研究鮑曼不動桿菌的耐藥機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年1月至2014年6月西安交通大學第二附屬醫院臨床送檢標本中分離鑒定的非重復性鮑曼不動桿菌共 124株，鮑曼不動桿菌A601(由西安交通大學醫學院微生物實驗室提供)為生物被膜陽性對照株。

1.1.2 主要儀器 Vitek-2細菌全自動鑒定儀(法國梅里埃生物公司)，PTC-200梯度PCR儀(美國MJ Research公司)，PAC300型電泳儀(美國Bio-Rad公司)，GelDoc2000凝膠成像系統(美國 Bio-Rad公司)，96孔板酶標儀(德國BMG Lab Technologies公司)，ND-1000分光光度計(德國Implen公司)。

1.1.3 主要試劑 MH瓊脂粉，LB培養基，0.25 g/L結晶紫染液，分析純無水乙醇，溴化乙錠，Premix Taq Version 2.0，DL2000 DNA Marker，DNA提取試劑盒，RNAiso plus，cDNA逆轉錄試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜形成能力的測定

生物被膜形成能力測定：將124株臨床分離鮑曼不動桿菌制備濃度為1*109CFU/ml的過夜菌液，取20 μl接種于聚乙烯96孔板(每孔含180 μl LB培養基，邊孔加入等量PBS緩沖液)，每株菌做6個復孔，37℃靜置培養，24 h換液，于第5天測定其再590 nm 處的吸光度(OD)值。測定前用無菌蒸餾水輕洗3次，除去浮游菌,自然風干后加入0.25 g/L結晶紫染液200 μl,室溫染色20 min,用蒸餾水洗去染液，自然風干后用95%乙醇萃取10 min。重復測定3次。結果判定參照文獻[6]，空白對照OD值的均值±標準差定義為ODc,待測菌株的OD值與ODc比較，OD≤2*ODc為生物被膜形成陰性株；OD>2*ODc為生物被膜形成陽性株，其中，2*ODc4*ODc為生物被膜形成能力強菌株。

生物被膜菌的制備：根據生物被膜形成能力測定結果，隨機選擇20株生物被膜形成能力陽性的菌株。制備濃度為1*109CFU/ml的過夜菌液，取200 μl接種于聚乙烯6孔板中，37℃靜置培養，24 h換液，每株菌做3個復孔。待生長至第3天和第5天時，分別用細胞刮刮取6孔板底部及孔壁上的生物被膜菌，打散備用。

1.2.2 外膜蛋白caro 基因檢測

對隨機抽樣生物被膜形成能力陽性的20株鮑曼不動桿菌，基因組DNA提取按照DNA提取試劑盒步驟進行。caro基因引物序列見表1。PCR反應總體積為25 μl，其中2*Taq Mix 12.5 μl，模板DNA2 μl，上下游引物各0.5 μl，滅菌蒸餾水補足至25 μl。另設空白對照。PCR反應條件：94℃3 min酶激活、DNA預變性；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0.5 μg/ml)進行電泳分析，凝膠成像分析系統觀察并照相。隨機挑選1例PCR陽性產物進行純化和序列測定。測序結果在GenBank數據庫中進行對比。

表1 外膜蛋白caro基因的引物序列

1.2.3 RT-PCR檢測鮑曼不動桿菌外膜蛋白基因caro的表達水平

按照RNAiso plus試劑盒提取生物被膜菌和相應液相培養菌的總RNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用ND-1000分光光度計檢測RNA純度和濃度，RNA純度及完整性符合要求的進行逆轉錄。用逆轉錄試劑盒(Takara)合成cDNA置于-20℃冰箱保存。

RT-PCR擴增：引物設計參照表1，16sRNA用做內參照。按不同比例稀釋cDNA使其終濃度約為100 ng/ul,反應體系和反應條件與普通PCR擴增反應一致。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，用凝膠成像分析系統觀察并照相。經光密度儀掃描，目的基因的相對表達量用(IA比值)=目的基因IA/內參照基因IA。

2 結果

2.1 生物被膜形成能力測定

對培養至第5天的124株臨床分離鮑曼不動桿菌進行生物被膜形成能力測定，33.87%(42株)生物被膜形成陰性，66.13%(82株)生物被膜形成陽性，其中19.35%(24株)生物被膜形成能力強，46.77%(58株)生物被膜形成能力弱。

2.2 外膜蛋白基因caro的PCR擴增

對隨機抽樣的20株鮑曼不動桿菌進行caro基因擴增，其中17株擴增出位于750 bp左右的陽性DNA片段。擴增電泳圖見圖1。隨機抽樣1例擴增陽性產物進行測序，與GenBank登錄號為EF646275的鮑曼不動桿菌外膜蛋白基因caro比對，同源性達99%。

2.3 外膜蛋白基因caro的RT-PCR結果

采用RT-PCR方法檢測鮑曼不動桿菌不同生物被膜形成時期外膜蛋白基因caro的表達水平結果顯示：隨著生物被膜的逐漸成熟，外膜蛋白基因caro的表達水平逐漸降低。電泳結果如圖2。

注：M：DNA標記物；1-16：分別為臨床分離菌株圖1 鮑曼不動桿菌caro基因PCR產物電泳圖

注：M：DNA標記物；1-4：浮游菌狀態caro基因表達；5-8：生物被膜第3天caro基因表達；9-12：生物被膜第5天caro基因表達；14-25：內參16sRNA表達。

圖2 鮑曼不動桿菌caro基因RT-PCR產物電泳圖

鮑曼不動桿菌caro基因的mRNA相對表達量數據見表2所示。在浮游菌狀態下，外膜蛋白基因caro表達量較高；生物被膜形成的第3天，基因caro的mRNA相對表達水平較前減低，為浮游狀態下的0.76倍，減低幅度較大；到生物被膜形成的第5天，基因caro的表達量繼續減弱，為浮游狀態下的0.65倍，減低幅度較小。對生物被膜形成不同時期外膜蛋白基因caro的mRNA相對表達量進行方差分析，外膜蛋白基因caro在生物被膜生長的不同時期其表達水平的差異有統計學意義(P值<0.05)；進一步組間比較顯示，外膜蛋白基因caro表達水平在浮游菌和生物被膜第3天，浮游菌和生物被膜第5天差異有統計學意義(P值均<0.05)，而在生物被膜第3天和生物被膜第5天其表達水平差異無統計學意義(P值=0.212)。

表2 鮑曼不動桿菌不同生長天數caro基因的相對灰度值(均值±標準差)

注：1.P值采用完全隨機設計方差分析計算。2.用LSD法多重比較不同生長天數caro基因的相對灰度值，浮游菌和第3天以及浮游菌和第5天的P<0.05，第3天和第5天，P>0.05，第3天和第5天caro基因的相對表達量差異無統計學差異。

3 討論

鮑曼不動桿菌廣泛存在于自然界、醫院環境及人體皮膚、粘膜、呼吸道、泌尿道中，其所引起的院內獲得性感染已成為患者高發病率、高病死率的主要原因之一，特別是ICU和免疫力低下患者。由于其耐藥機制復雜，獲得耐藥性速度快，對臨床目前使用抗菌藥物廣泛耐藥，已成為臨床治療的難題，應引起高度重視和關注。

生物被膜是由細菌通過自身分泌的胞外多糖基質、脂蛋白和纖維蛋白質等復合物，使細菌相互粘連并將其自身的克隆產物聚集纏繞而形成的膜樣物結構。細菌形成生物被膜后，由于生物被膜物理屏障作用和生物被膜內部特殊的微環境，可能使其耐藥性發生改變。研究證實具有生物膜形成能力的鮑曼不動桿菌菌株的耐藥率顯著高于無生物膜形成能力的菌株[4]。同時，細菌在形成生物被膜后，部分基因的表達水平和質粒的傳遞率與浮游菌狀態有所不同；Hendrickx等[5]發現生物被膜菌的質粒傳遞與浮游狀態菌相比較，其傳遞效率明顯增高。李樂等[6]發現鮑曼不動桿菌在形成生物被膜狀態下Ⅰ類整合子的表達量是浮游狀態下的9倍，Lee等[7]研究顯示在能形成生物被膜的鮑曼不動桿菌中，常有blaPER-1基因的高表達，提示二者可能存在某種聯系。此外，有研究顯示[8]生物被膜狀態的鮑曼不動桿菌相對于浮游菌有32種蛋白表達上調，20種蛋白質表達下調。

目前關于鮑曼不動桿菌在生物被膜形成的不同階段其外膜蛋白基因caro表達量的變化尚無報道。本實驗選擇生物被膜形成速度最快的第3天和生長成熟的第5天為觀測點，采用RT-PCR方法比較生物被膜形成不同時期caro基因mRNA表達量的變化。我們發現隨著生物被膜的逐漸成熟，外膜蛋白基因caro表達水平逐漸下調。可能的原因有以下幾點：(1)生物被膜內的細菌形成微菌落后，在菌落內部細菌個體在生長過程中會分泌一些小分子信號擴散至菌體周圍環境中，當小分子信號濃度增高達到一定閾值，就會調節某些特定基因的表達。Soren等[9]發現生物被膜狀態下這些小分子信號的濃度高于浮游狀態，在生物被膜狀態下細菌的基因水平轉移和DNA合成更頻繁。(2)細菌通過改變外膜蛋白的結構或者調節外膜蛋白的表達，來減少抗生素透入菌膜從而逃逸抗生素的殺菌作用[10]；此外，外膜蛋白是小分子親水物質進出細菌的通道，對生物被膜的形成有一定影響。

綜上所述，生物被膜形成與外膜蛋白系統密切相關，共同介導鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的高水平耐藥。然而鮑曼不動桿菌生物被膜形成與外膜蛋白基因的相互調控機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

[1]趙慧穎,楊艟舸,郭 楊,等.內科重癥監護病房泛耐藥鮑曼不動桿菌定植與感染的監測及控制[J].中華危重病急救醫學,2014,26(7):464.

[2]張東梅,徐韞健,李乃健,等.多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥分子機制及質粒譜分析[J].熱帶醫學雜志,2011,11(9):1023-1025,1042.

[3]Tomaras A P,Dorsey C W,Edelmann R E,et al.Attachment to and biofilm formation on abiotic surfaces by Acinetobacter baumannii:involvement of a novel chaperone-usher pili assembly system[J].Microbiology,2003,149(Pt 12):3473.

[4]Gurung J,Khyriem A B,Banik A,et al.Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit[J].Indian J Crit Care Med,2013,17(4):214.

[5]Hendrickx L,Hausner M,Wuertz S.Natural genetic transformation in monoculture Acinetobacter sp.strain BD413 biofilms[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(3):1721.

[6]李 樂,夏忠弟,胡朝暉,等.鮑曼不動桿菌I類整合酶基因在生物被膜內的表達及耐藥分析[J].中南大學學報(醫學版),2008,33(10):952.

[7]Lee H W,Koh Y M,Kim J,et al.Capacity of multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii to form biofilm and adhere to epithelial cell surfaces[J].Clin Microbiol Infect,2008,14(1):49.

[8]Marti S,Nait C Y,Alexandre S,et al.Growth of Acinetobacter baumannii in pellicle enhanced the expression of potential virulence factors[J].PLoS One,2011,6(10):e26030.

[9]Soren O,Brinch K S,Patel D,et al.Antimicrobial Peptide Novicidin Synergizes with Rifampin,Ceftriaxone,and Ceftazidime against Antibiotic-Resistant Enterobacteriaceae In Vitro[J].Antimicrob Agents Chemother,2015,59(10):6233.

[10]Hancock R E,Brinkman F S.Function of pseudomonas porins in uptake and efflux[J].Annu Rev Microbiol,2002,56:17.

Correlations of Acinetobacter baumannii biofilms to outer membrane proteins

ZHAOYu-jie,FENGYan-jing,LIUYuan,etal.

(TheSecondAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

Objective To study the correlation between biofilm formation and outer membrane protein gene caro expression in Acinetobacter baumannii.Methods We use the crystal-violet straning method to estimate the biofilm formation ability of A.baumannii.Reverse transcription polymerase chain reaction was applied to detect the expression level of caro gene throughout the course of biofilm formation.Results Majority (66.13%) of A.baumannii strains formed biofilm in vitro,the expression level of outer membrane protein gene caro was lower in biofilm strains than their planktonic counterparts.Conclusion Biofilm formation among the clinical isolates of Acinetobacter baumannii is closely correlated with outer membrane proteins.

Acinetobacter baumannii;Biofilm;Outer membrane protein gene

國家自然科學基金(81270061)陜西省科技攻關項目(2010K16-01(02))

*通訊作者

1007-4287(2017)06-1060-04

R378

A

趙玉杰(1987-)，女，住院醫師,碩士研究生，研究方向：肺部耐藥菌感染的診斷與防治。

2016-09-14)