鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜與外膜蛋白基因caro關(guān)系的研究

趙玉杰，馮雁京，劉 原*，和 平，張立然，楊 妮，敬 蓉，馬淑珍，劉聰蕊

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 急診科，陜西 西安710004)

鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜與外膜蛋白基因caro關(guān)系的研究

趙玉杰1，2，馮雁京1，劉 原1*，和 平1，張立然1，楊 妮3，敬 蓉1，馬淑珍1，劉聰蕊1

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 急診科，陜西 西安710004)

目的 研究鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成與外膜蛋白基因caro表達(dá)的關(guān)系。方法 結(jié)晶紫染色法檢測鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)比較臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌在生物被膜形成的不同階段外膜蛋白基因caro表達(dá)水平。結(jié)果 66.13%的臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力陽性；隨著生物被膜形成的成熟，外膜蛋白基因caro的表達(dá)水平下調(diào)。結(jié)論 臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成與外膜蛋白系統(tǒng)密切相關(guān)。

鮑曼不動(dòng)桿菌；生物被膜；外膜蛋白

(ChinJLabDiagn,2017,21:1060)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種需氧非發(fā)酵的革蘭陰性條件致病菌，易引起患者呼吸道、泌尿道、血液、傷口等感染的發(fā)生[1]。由于臨床上各類抗生素的廣泛使用所產(chǎn)生的選擇性壓力，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥形勢(shì)日益嚴(yán)峻[2]。目前有研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌的致病力和耐藥性與生物膜的形成有關(guān)[3]。鮑曼不動(dòng)桿菌的生物被膜形成與金屬離子、質(zhì)粒、整合子等基因以及外膜蛋白表達(dá)水平有關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)比較鮑曼不動(dòng)桿菌在生物被膜形成的不同階段，外膜蛋白基因caro的mRNA表達(dá)量變化，以期為研究鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年1月至2014年6月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床送檢標(biāo)本中分離鑒定的非重復(fù)性鮑曼不動(dòng)桿菌共 124株，鮑曼不動(dòng)桿菌A601(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供)為生物被膜陽性對(duì)照株。

1.1.2 主要儀器 Vitek-2細(xì)菌全自動(dòng)鑒定儀(法國梅里埃生物公司)，PTC-200梯度PCR儀(美國MJ Research公司)，PAC300型電泳儀(美國Bio-Rad公司)，GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)，96孔板酶標(biāo)儀(德國BMG Lab Technologies公司)，ND-1000分光光度計(jì)(德國Implen公司)。

1.1.3 主要試劑 MH瓊脂粉，LB培養(yǎng)基，0.25 g/L結(jié)晶紫染液，分析純無水乙醇，溴化乙錠，Premix Taq Version 2.0，DL2000 DNA Marker，DNA提取試劑盒，RNAiso plus，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜形成能力的測定

生物被膜形成能力測定：將124株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌制備濃度為1*109CFU/ml的過夜菌液，取20 μl接種于聚乙烯96孔板(每孔含180 μl LB培養(yǎng)基，邊孔加入等量PBS緩沖液)，每株菌做6個(gè)復(fù)孔，37℃靜置培養(yǎng)，24 h換液，于第5天測定其再590 nm 處的吸光度(OD)值。測定前用無菌蒸餾水輕洗3次，除去浮游菌,自然風(fēng)干后加入0.25 g/L結(jié)晶紫染液200 μl,室溫染色20 min,用蒸餾水洗去染液，自然風(fēng)干后用95%乙醇萃取10 min。重復(fù)測定3次。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[6]，空白對(duì)照OD值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差定義為ODc,待測菌株的OD值與ODc比較，OD≤2*ODc為生物被膜形成陰性株；OD>2*ODc為生物被膜形成陽性株，其中，2*ODc4*ODc為生物被膜形成能力強(qiáng)菌株。

生物被膜菌的制備：根據(jù)生物被膜形成能力測定結(jié)果，隨機(jī)選擇20株生物被膜形成能力陽性的菌株。制備濃度為1*109CFU/ml的過夜菌液，取200 μl接種于聚乙烯6孔板中，37℃靜置培養(yǎng)，24 h換液，每株菌做3個(gè)復(fù)孔。待生長至第3天和第5天時(shí)，分別用細(xì)胞刮刮取6孔板底部及孔壁上的生物被膜菌，打散備用。

1.2.2 外膜蛋白caro 基因檢測

對(duì)隨機(jī)抽樣生物被膜形成能力陽性的20株鮑曼不動(dòng)桿菌，基因組DNA提取按照DNA提取試劑盒步驟進(jìn)行。caro基因引物序列見表1。PCR反應(yīng)總體積為25 μl，其中2*Taq Mix 12.5 μl，模板DNA2 μl，上下游引物各0.5 μl，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μl。另設(shè)空白對(duì)照。PCR反應(yīng)條件：94℃3 min酶激活、DNA預(yù)變性；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0.5 μg/ml)進(jìn)行電泳分析，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并照相。隨機(jī)挑選1例PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行純化和序列測定。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對(duì)比。

表1 外膜蛋白caro基因的引物序列

1.2.3 RT-PCR檢測鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白基因caro的表達(dá)水平

按照RNAiso plus試劑盒提取生物被膜菌和相應(yīng)液相培養(yǎng)菌的總RNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用ND-1000分光光度計(jì)檢測RNA純度和濃度，RNA純度及完整性符合要求的進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)合成cDNA置于-20℃冰箱保存。

RT-PCR擴(kuò)增：引物設(shè)計(jì)參照表1，16sRNA用做內(nèi)參照。按不同比例稀釋cDNA使其終濃度約為100 ng/ul,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)一致。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并照相。經(jīng)光密度儀掃描，目的基因的相對(duì)表達(dá)量用(IA比值)=目的基因IA/內(nèi)參照基因IA。

2 結(jié)果

2.1 生物被膜形成能力測定

對(duì)培養(yǎng)至第5天的124株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行生物被膜形成能力測定，33.87%(42株)生物被膜形成陰性，66.13%(82株)生物被膜形成陽性，其中19.35%(24株)生物被膜形成能力強(qiáng)，46.77%(58株)生物被膜形成能力弱。

2.2 外膜蛋白基因caro的PCR擴(kuò)增

對(duì)隨機(jī)抽樣的20株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行caro基因擴(kuò)增，其中17株擴(kuò)增出位于750 bp左右的陽性DNA片段。擴(kuò)增電泳圖見圖1。隨機(jī)抽樣1例擴(kuò)增陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，與GenBank登錄號(hào)為EF646275的鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白基因caro比對(duì)，同源性達(dá)99%。

2.3 外膜蛋白基因caro的RT-PCR結(jié)果

采用RT-PCR方法檢測鮑曼不動(dòng)桿菌不同生物被膜形成時(shí)期外膜蛋白基因caro的表達(dá)水平結(jié)果顯示：隨著生物被膜的逐漸成熟，外膜蛋白基因caro的表達(dá)水平逐漸降低。電泳結(jié)果如圖2。

注：M：DNA標(biāo)記物；1-16：分別為臨床分離菌株圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌caro基因PCR產(chǎn)物電泳圖

注：M：DNA標(biāo)記物；1-4：浮游菌狀態(tài)caro基因表達(dá)；5-8：生物被膜第3天caro基因表達(dá)；9-12：生物被膜第5天caro基因表達(dá)；14-25：內(nèi)參16sRNA表達(dá)。

圖2 鮑曼不動(dòng)桿菌caro基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

鮑曼不動(dòng)桿菌caro基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)見表2所示。在浮游菌狀態(tài)下，外膜蛋白基因caro表達(dá)量較高；生物被膜形成的第3天，基因caro的mRNA相對(duì)表達(dá)水平較前減低，為浮游狀態(tài)下的0.76倍，減低幅度較大；到生物被膜形成的第5天，基因caro的表達(dá)量繼續(xù)減弱，為浮游狀態(tài)下的0.65倍，減低幅度較小。對(duì)生物被膜形成不同時(shí)期外膜蛋白基因caro的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行方差分析，外膜蛋白基因caro在生物被膜生長的不同時(shí)期其表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05)；進(jìn)一步組間比較顯示，外膜蛋白基因caro表達(dá)水平在浮游菌和生物被膜第3天，浮游菌和生物被膜第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而在生物被膜第3天和生物被膜第5天其表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值=0.212)。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌不同生長天數(shù)caro基因的相對(duì)灰度值(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：1.P值采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析計(jì)算。2.用LSD法多重比較不同生長天數(shù)caro基因的相對(duì)灰度值，浮游菌和第3天以及浮游菌和第5天的P<0.05，第3天和第5天，P>0.05，第3天和第5天caro基因的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境及人體皮膚、粘膜、呼吸道、泌尿道中，其所引起的院內(nèi)獲得性感染已成為患者高發(fā)病率、高病死率的主要原因之一，特別是ICU和免疫力低下患者。由于其耐藥機(jī)制復(fù)雜，獲得耐藥性速度快，對(duì)臨床目前使用抗菌藥物廣泛耐藥，已成為臨床治療的難題，應(yīng)引起高度重視和關(guān)注。

生物被膜是由細(xì)菌通過自身分泌的胞外多糖基質(zhì)、脂蛋白和纖維蛋白質(zhì)等復(fù)合物，使細(xì)菌相互粘連并將其自身的克隆產(chǎn)物聚集纏繞而形成的膜樣物結(jié)構(gòu)。細(xì)菌形成生物被膜后，由于生物被膜物理屏障作用和生物被膜內(nèi)部特殊的微環(huán)境，可能使其耐藥性發(fā)生改變。研究證實(shí)具有生物膜形成能力的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的耐藥率顯著高于無生物膜形成能力的菌株[4]。同時(shí)，細(xì)菌在形成生物被膜后，部分基因的表達(dá)水平和質(zhì)粒的傳遞率與浮游菌狀態(tài)有所不同；Hendrickx等[5]發(fā)現(xiàn)生物被膜菌的質(zhì)粒傳遞與浮游狀態(tài)菌相比較，其傳遞效率明顯增高。李樂等[6]發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌在形成生物被膜狀態(tài)下Ⅰ類整合子的表達(dá)量是浮游狀態(tài)下的9倍，Lee等[7]研究顯示在能形成生物被膜的鮑曼不動(dòng)桿菌中，常有blaPER-1基因的高表達(dá)，提示二者可能存在某種聯(lián)系。此外，有研究顯示[8]生物被膜狀態(tài)的鮑曼不動(dòng)桿菌相對(duì)于浮游菌有32種蛋白表達(dá)上調(diào)，20種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。

目前關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌在生物被膜形成的不同階段其外膜蛋白基因caro表達(dá)量的變化尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇生物被膜形成速度最快的第3天和生長成熟的第5天為觀測點(diǎn)，采用RT-PCR方法比較生物被膜形成不同時(shí)期caro基因mRNA表達(dá)量的變化。我們發(fā)現(xiàn)隨著生物被膜的逐漸成熟，外膜蛋白基因caro表達(dá)水平逐漸下調(diào)。可能的原因有以下幾點(diǎn)：(1)生物被膜內(nèi)的細(xì)菌形成微菌落后，在菌落內(nèi)部細(xì)菌個(gè)體在生長過程中會(huì)分泌一些小分子信號(hào)擴(kuò)散至菌體周圍環(huán)境中，當(dāng)小分子信號(hào)濃度增高達(dá)到一定閾值，就會(huì)調(diào)節(jié)某些特定基因的表達(dá)。Soren等[9]發(fā)現(xiàn)生物被膜狀態(tài)下這些小分子信號(hào)的濃度高于浮游狀態(tài)，在生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌的基因水平轉(zhuǎn)移和DNA合成更頻繁。(2)細(xì)菌通過改變外膜蛋白的結(jié)構(gòu)或者調(diào)節(jié)外膜蛋白的表達(dá)，來減少抗生素透入菌膜從而逃逸抗生素的殺菌作用[10]；此外，外膜蛋白是小分子親水物質(zhì)進(jìn)出細(xì)菌的通道，對(duì)生物被膜的形成有一定影響。

綜上所述，生物被膜形成與外膜蛋白系統(tǒng)密切相關(guān)，共同介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的高水平耐藥。然而鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成與外膜蛋白基因的相互調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

[1]趙慧穎,楊艟舸,郭 楊,等.內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)病房泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌定植與感染的監(jiān)測及控制[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué),2014,26(7):464.

[2]張東梅,徐韞健,李乃健,等.多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥分子機(jī)制及質(zhì)粒譜分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2011,11(9):1023-1025,1042.

[3]Tomaras A P,Dorsey C W,Edelmann R E,et al.Attachment to and biofilm formation on abiotic surfaces by Acinetobacter baumannii:involvement of a novel chaperone-usher pili assembly system[J].Microbiology,2003,149(Pt 12):3473.

[4]Gurung J,Khyriem A B,Banik A,et al.Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit[J].Indian J Crit Care Med,2013,17(4):214.

[5]Hendrickx L,Hausner M,Wuertz S.Natural genetic transformation in monoculture Acinetobacter sp.strain BD413 biofilms[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(3):1721.

[6]李 樂,夏忠弟,胡朝暉,等.鮑曼不動(dòng)桿菌I類整合酶基因在生物被膜內(nèi)的表達(dá)及耐藥分析[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,33(10):952.

[7]Lee H W,Koh Y M,Kim J,et al.Capacity of multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii to form biofilm and adhere to epithelial cell surfaces[J].Clin Microbiol Infect,2008,14(1):49.

[8]Marti S,Nait C Y,Alexandre S,et al.Growth of Acinetobacter baumannii in pellicle enhanced the expression of potential virulence factors[J].PLoS One,2011,6(10):e26030.

[9]Soren O,Brinch K S,Patel D,et al.Antimicrobial Peptide Novicidin Synergizes with Rifampin,Ceftriaxone,and Ceftazidime against Antibiotic-Resistant Enterobacteriaceae In Vitro[J].Antimicrob Agents Chemother,2015,59(10):6233.

[10]Hancock R E,Brinkman F S.Function of pseudomonas porins in uptake and efflux[J].Annu Rev Microbiol,2002,56:17.

Correlations of Acinetobacter baumannii biofilms to outer membrane proteins

ZHAOYu-jie,FENGYan-jing,LIUYuan,etal.

(TheSecondAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

Objective To study the correlation between biofilm formation and outer membrane protein gene caro expression in Acinetobacter baumannii.Methods We use the crystal-violet straning method to estimate the biofilm formation ability of A.baumannii.Reverse transcription polymerase chain reaction was applied to detect the expression level of caro gene throughout the course of biofilm formation.Results Majority (66.13%) of A.baumannii strains formed biofilm in vitro,the expression level of outer membrane protein gene caro was lower in biofilm strains than their planktonic counterparts.Conclusion Biofilm formation among the clinical isolates of Acinetobacter baumannii is closely correlated with outer membrane proteins.

Acinetobacter baumannii;Biofilm;Outer membrane protein gene

國家自然科學(xué)基金(81270061)陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2010K16-01(02))

*通訊作者

1007-4287(2017)06-1060-04

R378

A

趙玉杰(1987-)，女，住院醫(yī)師,碩士研究生，研究方向：肺部耐藥菌感染的診斷與防治。

2016-09-14)