地砷病區乳腺癌致病機制研究

張明明,李 婷,鄭春雨,董 雪*

(1.吉林省人民醫院,吉林 長春130021; 2.長春中醫藥大學)

地砷病區乳腺癌致病機制研究

張明明1,李 婷2,鄭春雨2,董 雪2*

(1.吉林省人民醫院,吉林 長春130021; 2.長春中醫藥大學)

目的 研究亞砷酸鈉(NaAsO2)對小鼠乳腺上皮細胞(NMuMG)增殖的抑制作用機制，為地砷病區乳腺癌致病機制提供理論依據。方法 以不同濃度的NaAsO2(0,5,10，20,30 μM)處理的NMuMG，觀察其形態的變化；經Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 測定不同濃度NaAsO2對NMuMG增殖情況；用實時定量RT-PCR 分析增殖基因c-myc mRNAs的表達水平。結果 在一定濃度范圍內，隨亞砷酸鈉濃度升高，其細胞間隙變寬、形狀不規則，甚至凋亡。在一定濃度范圍內，隨著NaAsO2濃度增高其增殖明顯受到抑制，呈明確的劑量-效應關系； 20 μM NaAsO2使c-myc mRNA表達水平明顯降到11%。結論 亞砷酸鈉抑制NMuMG的增殖是通過降低增殖基因c-myc的表達來實現的，這是地砷病區乳腺癌疾病高發的原因之一。

亞砷酸鈉;增殖;c-myc

(ChinJLabDiagn,2017,21:1064)

乳腺癌是占女性死亡第二位的惡性腫瘤，且其發病率在近30年正逐漸上升[1,2]。流行病學調查顯示，地砷病區其乳腺癌的發病率高于其他地區，吉林省就是飲水中砷含量超標的地砷病區[3]。在美國環境保護協會和國際癌癥研究中心發布的Ⅰ類致癌藥物砷已位列其中[4]。由于砷致癌機制十分復雜，目前不是十分清楚，本研究檢測了一定劑量范圍內亞砷酸鈉對小鼠乳腺上皮細胞的形態及增殖影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 亞砷酸鈉(NaAsO2)、胰島素，購于SIGMA公司；小鼠乳腺上皮細胞(NMuMG)由瑞典大學ARIS教授友情饋贈，Gibco公司提供(Dulbecco's Modified Eagle Media ，DMEM)培養基；北京元亨金馬生物公司提供優級胎牛血清；碧云天公司提供CCK-8試劑盒購自于；Takara 公司提供Trizol試劑盒、RT-PCR 試劑盒；ABI 公司提供 2 *SYBR Green Ⅰ試劑。

1.2 細胞培養 NMuMG培養條件是在含10 %胎牛血清+10 μg/ml胰島素的DMEM 培養基中，置于37 ℃、5 % CO2恒溫培養箱中培養。

1.3 細胞形態的觀察 將指數增長期的NMuMG制成單細胞懸液，接種于24孔板每孔密度3*103/ml，每孔1.5 ml培養基，待細胞長至70%-80%融合后，(0,5,10，20,30) μM NaAsO2溶液替換原有培養基，作用24 h后，利用共聚焦顯微鏡觀察細胞形態，并照相。

1.4 細胞增殖情況檢測 將指數生長期細胞制成單細胞懸液，接種于96 孔板， 5*103個細胞/ 孔，100 μl/ 孔，每孔均是不同濃度亞砷酸鈉溶液(每個濃度設4個復孔)，作用24小時后，將10 μl CCK-8加入每孔中，并將孔板重新置于培養箱中，繼續孵育1 小時，室溫下振蕩5 分鐘，酶標儀檢測其在450 nm吸光度值，獨立實驗重復3次，并計算存活率。

細胞增殖抑制率(%)= [ (1-實驗組平均OD值) /對照組平均OD值]*100%；

1.5 實時定量RT-PCR檢測 提取細胞總RNA，并將mRNA逆轉錄為cDNA(具體操作步驟均按廠家產品說明書進行)，其反應條件為：30℃、10 min，42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min。c-Myc采用實時定量RT-PCR(SYBR Green 法) 進行，反應體積為25 μl，反應程序為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；92 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共50個循環。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 細胞形態變化

利用共聚焦顯微鏡觀察亞砷酸鈉對NMuMG形態的影響，DIC照相。結果發現，0 μM對照組細胞呈上皮細胞的形態，細胞間連接緊密且貼壁生長，狀態良好；經不同濃度亞砷酸鈉作用24 h后，隨著其濃度升高，細胞間隙逐漸變大，細胞形狀不規則，有部分細胞出現空泡，漂浮的死細胞越來越多(圖1)。

表1 PCR擴增所用引物

注：亞砷酸鈉濃度A:0 μM B:5 μM C:10 μM D:20 μM E:30 μM圖1 亞砷酸鈉改變NMuMG的形態(200*)

2.2 NaAsO2抑制NMuMG增殖

用CCK-8試劑檢測細胞增殖情況。以不同濃度的亞砷酸鈉處理NMuMG，作用24 h后，發現隨著亞砷酸鈉濃度的增高，細胞增殖均呈不同程度的抑制(圖2)，當濃度達到10μM時，即有統計學意義(P<0.05)，且有劑量-效應關系。

2.3 NaAsO2降低增殖基因c-Myc mRNA表達水平

c-Myc是細胞增殖相關基因，其表達水平降低，細胞增殖即受抑制，進而導致細胞凋亡。將20 μM的NaAsO2作用小鼠乳腺上皮細胞24 h后收集細胞，并提取RNA，同時進行實時定量RT-PCR檢測。本實驗結果均經過內參及未處理組校正過，每次2個副孔且實驗重復3次。實驗結果表明：NMuMG經20 μM NaAsO2作用后，其c-Myc的mRNA表達水平明顯降低到11%，統計學有顯著性差異(P<0.01)，如圖3所示，這表明NaAsO2通過降低c-Myc的mRNA表達水平來抑制NMuMG增殖。

*P<0.05 **P<0.01圖2 亞砷酸鈉抑制NMuMG增殖

**P<0.01圖3 NaAsO2 抑制NMuMG C- MYC mRNA的表達

3 討論

中國一直是飽受砷污染的國家，其中吉林、新疆、云南、山西等省份尤為嚴重，比較常見的是飲水中砷含量超標。這些地區的女性乳腺癌發病率遠高于其他地區，為了解砷致乳腺癌的致癌機理，本研究以NMuMG為研究對象，觀察砷對其毒性作用。

本研究中，NMuMG發現經不同濃度的NaAsO2作用后，其形態發生顯著變化，細胞間隔變大，形態各異，且隨著NaAsO2濃度上升，導致凋亡的細胞逐漸增多。CCK-8檢測結果充分說明了NaAsO2明顯抑制了NMuMG的增殖且呈典型的劑量-效應關系。Liy等人將5 μM As2O3牛主動脈內皮細胞，僅4 h即導致細胞 DNA 鏈的斷裂[5]，Barchowsky等人將5 μM As2O3作用血管內皮細胞僅4 h，其細胞DNA合成就受到抑制[6]。

c-Myc是與細胞增殖有關的基因，細胞增殖過程中其表達水平升高。在本研究中NMuMG經20μM NaAsO2作用24小時后，c-Myc的mRNA表達顯著降低，說明NaAsO2對NMuMG的增殖抑制作用是通過抑制c-Myc表達而實現的。

許多研究結果表明，砷化物通過抑制細胞的增殖，從而引起凋亡來發揮其毒性作用的。如Shah P等人發現小鼠通過飲水長期攝入低劑量砷后，皮膚細胞的增殖受到抑制進而凋亡從而導致皮膚癌[7]。在我們的前期研究中就發現低濃度的亞砷酸鈉即可抑制人臍靜脈血管內皮細胞增殖[8]。Hu,Y等人研究發現低劑量的亞砷酸鹽、長時間作用于正常人體細胞，常見的慢性砷中毒(地砷病)會通過下調NF-kB的DNA結合，而NF-kB是抗凋亡轉錄因子，凋亡細胞減少，引起腫瘤的發生[9]。本研究發現一定劑量的砷作用于小鼠乳腺上皮細胞導致其增殖受到抑制，這可能是其致乳腺癌機制之一。

[1]Upreti M,Jyoti A,Johnson SE,et al.Radiation-enhanced therapeutic targeting of galectin-1 enriched malignant stroma in triple negative breast cancer[J].Oncotarget,2016,7(27):41559.

[2]Pineda-Belmontes CP,Hernández-Ramírez RU,Hernández-Alcaraz C,et al.Genetic polymorphisms of PPAR gamma,arsenic methylation capacity and breast cancer risk in Mexican women[J].Salud Publica Mex,2016,58(2):220.

[3]張海濤,張秀麗,姜 爽,等.吉林省防砷改水現狀分析[J].中國地方病防治雜志,2013,28(4):263.

[4]Morita T,Uneyama C.Genotoxicity assessment of 4-methylimidazole:regulatory perspectives[J].Genes Environ,2016,38(20).

[5]Liu F,Jan KY.DNA damage in arsenite- and cadmium-treated bovine aortic endothelial cells[J].Free Radic Biol Med,2000,28(1):55.

[6]Barchowsky A.Arsenic induces oxidant stress and NF-kappa B activation in cultured aortic endothelial cells[J].Free Radic Biol Med,1996,21(6):783.

[7]Shah P,Trinh E,Qiang L,et al.Arsenic Induces p62 Expression to Form a Positive Feedback Loop with Nrf2 in Human Epidermal Keratinocytes:Implications for Preventing Arsenic-Induced Skin Cancer[J].Molecules,2017,22(2)：194.

[8]董 雪,史艷芬,呂 慧.亞砷酸鈉對血管增殖效應的體內體外研究[J].中國實驗診斷學,2010,14(11):1709.

[9]Vogt BL,Rossman TG.Effects of arsenite on p53,p21 and cyclin D expression in normal human fibroblasts-a possible mechanism for arsenite's comutagenicity[J].Mutat Res,2001，478(1-2):159.

Study on Pathogenic Mechanism of Breast Cancer in Arsenic Ward

ZHANGMing-ming,LiTing,ZHENGChun-yu,etal.

(People'sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Objective The studies were carried out to explore the effect of sodium arsenite on the proliferation of mouse mammary epithelial cells (NMuMG) and its molecular mechanisms.Methods The changes of NMuMG were observed by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) at different concentrations of NaAsO2(0,5,10,20,30 μM).The proliferation of NMuMG was determined by real-time quantitative RT The expression of proliferating gene c-myc mRNAs was analyzed by PCR.Results In a certain concentration range,with the concentration of sodium arsenate increased,the cell gap widened,irregular shape,and even apoptosis.In a certain concentration range,the proliferation was significantly inhibited with the increase of NaAsO2concentration,showing a clear dose-effect relationship;20 μM NaAsO2significantly reduced the expression of c-myc mRNA to 11%.Conclusion and Discussion:Sodium arsenite may further inhibit the proliferation of NMuMG by downregulating the expression of c-myc gene,which may be one of the mechanisms of endemic arsenic poisoning leading to breast cancer.

Arsenic;Proliferation;c-myc

吉林省教育廳項目(20163)

*通訊作者

1007-4287(2017)06-1064-03

R737.9

A

張明明，男，副教授，研究方向：神經內科及老年病學;董雪，女，博士，副教授，研究方向地方病學及老年病方面的研究。

2016-12-17)