不同比例PLLA/PDLLA/5%HA復合物體外降解性能的研究

徐高祥,張魯魯,高華麗,楊 雪,姜 秋*,金志恩

(1.吉林大學口腔醫院 兒童口腔科 吉林 長春130021；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室 吉林 長春130021)

不同比例PLLA/PDLLA/5%HA復合物體外降解性能的研究

徐高祥1,2,張魯魯1,高華麗1,楊 雪1,姜 秋1,2*,金志恩1

(1.吉林大學口腔醫院 兒童口腔科 吉林 長春130021；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室 吉林 長春130021)

目前，乳牙殘冠殘根的修復治療方法主要有常規的充填修復，金屬預成冠及前牙透明冠、短樁修復等，而最近可吸收乳牙根管樁成為國內外學者的研究熱點。而聚乳酸(polyactic acid,PLA)因其具有良好的生物相容性、降解性和無毒性[1]，且易于加工成型[2]已經成為應用于生物醫學的可降解材料的首選聚合物。聚乳酸存在三種立體構型,即:聚左旋乳酸(PLLA),聚右旋乳酸(PDLA)聚消旋乳酸(PDLLA)。其中PLLA和PDLA是兩種具有光學活性的規則立構型聚合物,分子鏈排列比較規整,有較高的結晶度和機械強度，而PDLLA是無定形非晶態材料，具有良好的生物相容性和可吸收性[3]。由于PLLA具有易結晶及結晶度較高的特點，用 PLLA 制備的試件脆性高，物理性能不理想，而作為植入材料在體內降解時產生的乳酸易引發炎癥，同時還具有x-射線下不顯影等缺陷[4]，因此，單純將PLLA作為乳牙根管樁的材料并不理想。羥基磷灰石(HA)，因其晶體結構與自然骨無機成分相似，能夠與人體細胞膜表層蛋白質和多糖以氫鍵結合[5]，還具有抗菌、抑菌性及良好的細胞黏附特性，目前是口腔醫學中最常用的生物陶瓷材料。本課題組之前將PLLA與HA混合，通過溶液共混法和熱壓成型法制備PLLA/HA復合材料,得出HA質量分數為5%的PLA/HA復合物具有最優的力學性能，并且符合生物安全性要求。

另外，乳牙牙根生理性吸收一般為2-4年，但PLLA因其纖維結構較規整，具有較高的結晶度(83.5%)，因此降解時間長，一般完全降解為2-6年，若使用單純PLLA作為可吸收乳牙根管樁，不能完全滿足與乳牙根同步吸收的要求，而非晶態的PDLLA降解速度較PLLA快的多[6]。因此，在保證力學性能的基礎上，本實驗將PDLLA與PLLA、HA按一定的比例共混復合來調控復合物的降解速度，以期找到一種合適的復合物比例，實現與乳牙牙根生理性吸收的同步。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

PLA-5%HA(質量分數PLLA：PDLLA為80:15，75:20,70:25)板塊(上海麗昂化學有限公司合成)，規格為50 mm*10 mm*4 mm；JF1004電子分析天平(躍平科學儀器有限公司，上海)；電熱恒溫培養箱(科偉實驗儀器有限公司，北京)；冷場發射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)；便攜PH計(哈納，意大利)；萬能材料試驗機(島津公司，香港)；X線多晶衍射儀(日本理學電子株式會社)；DZF-6050真空恒溫干燥箱(新諾儀器設備有限公司，上海)；凝膠滲透色譜儀(島津公司，香港)。

1.2 實驗方法

1.2.1 磷酸鹽緩沖液(PBS)中降解 將準確稱取質量后的三種比例PLLA/PDLLA/5%HA及單純PLLA試件放入盛有50 ml PBS(pH約為7.4，濃度為0.1 mol/L)的試管中，每個試管中放入1個試件,置于(37℃±1℃)的恒溫箱中，每組設3個平行組，每1周更換一次PBS液，保持pH值恒定，分別于2,4,6,8,10個月取出試件，用濾紙吸去試件表面的水分后，真空干燥至恒重。

非緩沖溶液中降解 將準確稱取質量后的三種比例PLLA/PDLLA/5%HA及單純PLLA試件放入盛有50 ml蒸餾水(pH為6.4)的試管中，每個試管中放入1個試件，置于(37℃±1℃)的恒溫箱中，每組設3個平行組，分別于相同時間點測定浸泡液體的pH值。

1.2.2 試件大體觀察 取出不同時間點的試件，肉眼觀察試件表面形態，色澤以及透明度的變化。

1.2.3 SEM形貌分析 將不同時間點取出的試件斷口噴金，進行掃描電鏡分析，與材料的原始形貌對比，觀察材料的降解情況。

1.2.4 分子量測定并計算降解率 取出不同時間點的試件干燥至恒重，以氯仿為溶劑，采用GPC儀來測定試件的重均分子量(Mw)。將降解前試件的分子量記為Mw0，降解后的分子量記為Mwn。

降解率=(Mw0-Mwn)/Mw0*100%

1.2.5 力學性能測試 將不同時間點的試件利用電子萬能試驗機進行三點彎曲測定，跨距為40 mm,加載速度為1 mm/s，測得試件的最大斷裂力值，并計算出其彈性模量及彎曲強度。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 試件大體觀察

純PLLA初始呈近透明狀，光澤度良好[圖1(B1)]，PLA/HA復合材料呈乳白色，光澤度良好且不透明[圖1(A1、C1、D1)]；2個月后，復合材料表面開始變白，變白程度70%PLLA-25%PDLLA-5%HA>75%PLLA-20%PDLLA-5%HA>80%PLLA-15%PDLLA-5%HA,而單純PLLA在第4個月時開始部分變白且透明度變低[圖1(B3)]。70%PLLA-25%PDLLA-5%HA復合材料在第6個月、75%PLLA-20%PDLLA-5%HA復合材料在第8個月時，基本上完全變成了白色，表面稍變粗糙，并出現少量微裂紋[圖1(C4、D5)];10個月時，80%PLLA-15%PDLLA-5%HA復合材料完全變白，出現裂紋，而75%PLLA和70%PLLA組復合材料表面逐漸開始剝脫；純PLLA完全變白，失去光澤。[圖1(A6、C6、D6、B6)]。

2.2 掃描電鏡形貌分析

PLLA/PDLLA/5%HA復合物的初始形貌[圖2(D、G、J)]，可見到HA微球直徑約為5 μm，與PLA結合緊密，結合界面良好，但斷面有片層錯落的現象，是一種脆性斷裂。4個月時[圖2(E、H、K)]可見部分HA包裹在基質中，部分顆粒從基質斷面脫落，HA顆粒降解變小，直徑約為2.5 μm，復合材料斷面開始出現大小較為均一，直徑約為1 μm的孔隙；純PLLA[圖2(B)]由于自身降解作用，斷口表面也出現大量大小不等的孔隙，且呈明顯的不規則形。到第10個月時，純PLLA和80%PLLA-15%PDLLA-5%HA材料斷面[圖2(C、F)]空隙變大，數量較4月份時的更多；75%PLLA-20%PDLLA-5%HA和70%PLLA-25%PDLLA-5%HA復合材料[圖2(I、L)]斷口表面出現許多絮狀物，逐漸無成型的聚乳酸結構。

A為80%PLLA-15%PDLLA-5%HA復合物大體觀察,B為單純PLLA大體觀察,C為75%PLLA-20%PDLLA-5%HA復合物大體觀察,D為70%PLLA-25%PDLLA-5%HA復合物大體觀察

圖1 試件大體觀察

2.3 PLA/HA復合物與PLA力學性能的變化

圖3、4顯示，初始狀態下各組的彈性模量、彎曲強度接近，70%PLLA-25%PDLLA-5%HA最小。隨著降解時間的延長，各組PLLA/PDLLA/5%HA復合物與單純PLLA的彈性模量均有所衰減。在第8個月之前，80%PLLA-15%PDLLA-5%HA和75%PLLA-20%PDLLA-5%HA的彈性模量、彎曲強度一直高于單純PLLA，8個月之后，各組PLLA/PDLLA/5%HA復合物的彈性模量、彎曲強度均開始大幅度下降，第10個月時，70%PLLA-25%PDLLA-5%HA已經失去強度。而單純PLLA彈性模量始終以一個較為一致速度的衰減。

2.4 分子量測定及生物降解率

各組PLLA/PDLLA/5%HA和單純PLLA的初始重均分子量差別不是很大，單純PLLA略高于PLLA/PDLLA/5%HA復合物。前4個月單純PLLA的分子量下降較PLLA/PDLLA/5%HA略快。4個月后，各組材料的生物降解率均開始變快，8個月后PLLA/PDLLA/5%HA復合物的降解率開始變慢，但單純PLLA總體降解速度較為一致。降解10個月時，單純PLLA的降解率為70.5%，80%PLLA-15%PDLLA-5%HA為79.6%，75%PLLA-20%PDLLA-5%HA和70%PLLA-25%PDLLA-5%HA的降解率達到了90%左右。

2.5 PLLA/PDLLA/5%HA復合物及單純PLLA非緩沖液pH的變化

A、B、C為純PLLA原始形貌及降解4個月、10個月形貌；D、E、F為80%左旋聚乳酸復合物初始形貌及降解4個月、10個月形貌；G、H、I為75%左旋聚乳酸復合物初始形貌及降解4個月、10個月形貌；J、K、L為70%左旋聚乳酸復合物初始形貌及降解4個月、10個月形貌

圖2 PLLA/PDLLA/5%HA復合物與PLA斷口形貌.SEM (*3000)

圖3 PLLA/PDLLA/5%HA復合物與PLA彈性模量隨時間變化

圖4 PLLA/PDLLA/5%HA復合物與PLA彎曲強度隨時間變化

由圖5可見，在整個體外降解過程中，PLLA/PDLLA/5%HA復合物及單純PLLA的pH值曲線均呈倒“S”形，4個月以前，各組均下降緩慢，但單純PLLA的pH下降比PLLA/PDLLA/5%HA復合物略快；5-7個月，四組pH值均開始明顯下降，且單純PLLA的pH值比PLLA/PDLLA/5%HA復合物降低更為顯著；7-10個月時，四組的pH下降趨于平緩。

圖5 降解液pH值隨時間的變化

3 討論

目前，因聚乳酸具有良好的生物相容性、降解性和無毒性，且易于加工成型，已經廣泛作為生物醫學可降解材料的首選聚合物，為實現能與乳牙牙根同步吸收的修復方法提供了思路。如果單獨采用左旋聚乳酸(PLLA)，因其結晶度高(83.5%)，降解時間較長，一般完全降解需要2-6年，無法滿足乳牙牙根生理性吸收的要求。而非晶態的外消旋聚乳酸(PDLLA)降解速度較PLLA快的多。因此本實驗在保證力學性能的基礎上，將PDLLA與PLLA、HA按一定的比例共混來調控復合物的降解速度，尋找與乳牙根同步吸收的混合比。

聚乳酸的降解主要分為吸水、酯鍵斷裂、可溶性寡聚物擴散和碎片溶解的4個過程。通過水解作用可造成酯鍵的水解，高分子鏈發生斷裂，降解為乙醇酸和乳酸進入三羧酸循環，最終代謝為CO2和水而排出[7]。隨著觀察時間的延長，我們發現PLLA/PDLLA/5%HA復合物中部分HA顆粒從基質斷面脫落，基質表面出現了細小的空隙，水分子可能會通過這些孔隙進入材料的內部，催化水解反應。而且，有學者認為聚乳酸的降解是由于分子鏈端羧基引起的自催化水解，材料吸水后，PLA分子鏈上的酯鍵發生水解逐漸斷裂，從而造成末端羧基基團的增多，可導致局部pH降低[8]。

我們看到前4個月，各組pH均下降緩慢，且分子量的變化也相對較緩，降解率相差不大。這可能是因為，前4個月水分子只是通過親水力或其他作用力與聚乳酸結合，而未改變聚乳酸的化學結構。而這一階段，單純PLLA的pH值和分子量的下降比PLLA/PDLLA/5%HA復合物略快。究其原因，一方面可能是由于HA在中性介質中的溶解度很低[9],復合材料表面均勻分布著HA微粒阻擋了部分水分子向材料內的擴散 ,延緩了材料水解的速度[10]；另一方面,隨著材料的降解，HA在酸性環境中的溶解度逐漸增加，并有輕度Ca2+析出,Ca2+與聚合物的鏈端羧基形成離子鍵,自由鏈端羧基濃度減少[11],PLA的自催化速度有所抑制，降低了材料內部降解物質的自催化反應，同時對周圍的酸性產物起到了一定的緩沖，同時這也是PLLA/PDLLA/5%HA組的pH始終高于單純PLLA組的原因。在第5-7個月時，各組介質中的pH值均開始明顯的下降，而7個月后，四組的pH均趨于穩定。這可能是因為PLA發生了酯的水解作用，分子鏈發生斷裂,引起了低聚物和乳酸單體的濃度逐漸增加，7個月后PLA酯鍵斷裂趨勢有所下降，所釋放的乳酸單體的濃度變化不大，從而使得pH下降幅度有所減緩[12]。HA與PLLA/PDLLA降解時的協同效應導致了單純PLLA及PLLA/PDLLA/5%HA復合物的分子量、降解率和pH在降解過程中呈現出不均勻的狀態。

本實驗中80%PLLA-15%PDLLA-5%HA的初始彎曲強度為150.5MPa、75%PLLA-20%PDLLA-5%HA為149.9MPa、70%PLLA-25%PDLLA-5%HA為133.6MPa、純PLLA為144.2MPa，均高于ISO4049標準中的復合樹脂標準的彎曲強度80MPa，表明初始狀態的PLLA/PDLLA/5%HA復合材料及純PLLA的強度可以滿足臨床中殘根殘冠修復的抗折性要求。有研究表明[6,13]，PDLLA質量分數<20%時PDLLA與PLLA共聚物的結晶度變化不大，但高于20%后結晶度則迅速降低；同時HA的加入也會影響PLA的結晶度，引起分子量的下降。復合材料的力學強度會隨著PDLLA質量分數的增加迅速減小(由圖3、4 可看出)，本實驗中隨著PDLLA含量的增多，復合物力學性能的下降速度也相對變快。前8個月，80%PLLA-15%PDLLA-5%HA和75%PLLA-20%PDLLA-5%HA的彎曲強度和彈性模量均高于單純PLLA，而70%PLLA/HA因其PDLLA的含量高，結晶度低導致降解速度較快，很快失去強度。HA的加入，延緩了復合材料早期的降解速度,有利于材料初始強度的保持[13]。威廉[14]等認為理想的根管樁材料應與牙本質的機械性能相似，PLLA/PDLLA/5%HA與單純PLLA初期的彎曲強度與牙本質(102-138 MPa)較為接近，而彈性模量3.3～4.3GPa與牙本質(12-18GPa)仍存在不少差距。根據力學原理，當外力作用于一個復合體時，力總是從彈性模量高的材料向彈性模量低的材料傳遞，聚乳酸根管樁材料比牙本質的彈性模量小，可減少應力集中，使根管治療后脆性變大的牙齒不易折斷[15]。據文獻記載[16,17]3-5.5歲兒童的咬合力為213.17±43.97N，牙合接觸面積為129.52±31.12 mm2，計算得出乳牙單位面積的最大力約為2.61 MPa。降解10個月后，除了70%PLLA-25%PDLLA-5%HA組失去力學強度外，其他三組最低值為12.63 MPa仍大于2.61 MPa(乳牙單位面積最大力)，說明降解10個月后的聚乳酸材料若應用于乳牙根管可以承受兒童的最大咬合力。這僅是我們觀察了10個月的PLA/HA復合物的體外降解行為，根據其彎曲強度和彈性模量曲線來推測達到乳牙的最大咬合力值仍需很長一段時間，由此可看出PLLA/PDLLA/5%HA復合物可以成為理想的乳牙根管樁材料。

通常，可降解材料在體內降解時除了材料自身的降解作用，還會受到體內細胞、酶、機械應力等對材料的介導作用，因而材料在體內降解的速度可能會較體外更快。而本實驗所研究的聚乳酸乳牙根管樁的應用環境是相對干燥的根管腔，因此復合材料的降解速度會較體外實驗時緩沖液中的速度更慢。本實驗的結果顯示，單純PLLA雖然在十個月的時間內力學性能下降不大，但是根據降解曲線分析，待其完全降解仍需很長時間，可能很難滿足乳牙牙根同步吸收的要求；70%PLLA-25%PDLLA-5%HA的復合體材料降解速度最快，十個月的時間已經失去其力學性能，不能耐受咬合力的作用；75%PLLA-20%PDLLA-5%HA復合材料雖然降解速度較70%PLLA-25%PDLLA-5%HA更慢，但是其力學性能也維持不了更長的時間；而80%PLLA-15%PDLLA-5%HA的降解速度適中，力學性能維持的時間相對更久。因此，80%PLLA-15%PDLLA-5%HA復合物為能夠滿足乳牙牙根生理性吸收的理想根管樁材料的研究提供了方向。但是，其究竟能否真正實現與乳牙牙根吸收的同步還有需要進一步的體內實驗。

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吉林省工信廳項目(編號：2013220101000394)

*通訊作者

1007-4287(2017)06-1067-05

徐高祥(1990-)，男，碩士，主要從事兒童口腔醫學研究工作。

2016-11-14)