微小RNA146b通過靶向調節干擾素調節因子5控制M1型巨噬細胞極化

胡晶晶,李開學,劉若丹,熊 鷹

(深圳市第二人民醫院，廣東 深圳518029)

*通訊作者

微小RNA146b通過靶向調節干擾素調節因子5控制M1型巨噬細胞極化

胡晶晶,李開學,劉若丹,熊 鷹*

(深圳市第二人民醫院，廣東 深圳518029)

目的 為了證實miR-146b在小鼠M1/M2型巨噬細胞分化平衡中的作用和機制，我們通過分離小鼠骨髓來源巨噬細胞，在LPS和IFN-γ聯合刺激下促進M1型細胞分化；并結合李斯特菌感染和內毒性休克，共同證實miR-146b對M1型巨噬細胞分化的作用。方法 分離野生型(WT)和IL-10-/-小鼠骨髓細胞，采用GM-CSF誘導成為巨噬細胞。并在IL-10-/-M1型巨噬細胞中轉染miR-146b mimic；評價miR-146b對M1型巨噬細胞分化的影響，以及致炎因子TNF-γ、IL-6和IL-12等表達；采用miR-146b mimic處理李斯特菌感染和內毒性休克動物模型，評價miR-146b mimic對此模型的作用。結果 相對于scramble組，miR-146b mimic能明顯抑制IL-10缺失小鼠骨髓來源巨噬細胞向M1型分化，并降低了TNFα、IL-6和IL-12等表達。miR-146b mimic也明顯減弱了機體對李斯特感染的敏感性，導致肝臟和脾臟菌斑增多；此外，在高劑量LPS刺激下，miR-146b mimic延長了小鼠生存率，并且降低了致炎因子TNFα、IL-6和IL-12等表達。而且，IRF5可以作為miR-146b直接靶向因子。結論 miR-146b在小鼠M1型巨噬細胞激活過程作為一個負調控因子，起到了抑制炎癥的作用。

微小RNA146b; 干擾素調節因子5；巨噬細胞；骨髓來源的巨噬細胞

(ChinJLabDiagn,2017,21:1076)

巨噬細胞是一類可以持續保持激活狀態的高度異質性的細胞群。根據對微生物的信號和/或細胞因子刺激因素不同反應，巨噬細胞可以分化成經典激活的巨噬細胞(classically activated macrophages M1)和巨噬細胞(alternatively activated macrophages M 2)[1]。特異的細胞因子和微環境可以激活巨噬細胞，并且通過改變刺激因素能使不同激活狀態巨噬細胞相互轉化。由T輔助細胞Th1和自然殺傷細胞NK產生的干擾素(IFN-γ)能激活M1巨噬細胞；由中性粒細胞和其它抗原提呈細胞產生的腫瘤壞死因子TNFa以及經PAMPs介導的PRRs能通過激活SOCS3誘導M1巨噬細胞極化[2-5]。 M1巨噬細胞產生促炎細胞因子(IL-12，TNFa，和IL-6)和活性氧(ROS)及一氧化氮等，這些因子促進了T輔助細胞TH1和TH17活化[6,7]。盡管M1巨噬細胞消滅細胞內感染對保持機體內環境穩定是非常重要的，但同時M1巨噬細胞自身也產生促炎細胞因子參與IBD致病。而且，研究也正表明促進M1活性能加重組織損傷和增加宿主癌變發生風險以及誘發胰島素抵抗[8-10]。M1巨噬細胞參與結腸炎的發生發展;然而，M1巨噬細胞如何促進結腸炎的發生發展的機制目前仍不完全清楚。因此，了解M1巨噬細胞內在調節機制將更深入闡明炎癥性腸疾病的發病機制。Curtale等報道LPS刺激人類單核細胞后通過分泌IL-10反饋誘導miR-146b表達，并且靶向抑制TLR4信號途徑而起到抗炎作用[11]，那么是否miR-146b能調節巨噬細胞的分化平衡？在此項研究中，我們將對miR-146b對小鼠巨噬細胞分化平衡的調節機制及靶點展開研究。

1 材料與方法

1.1 小鼠 C57BL/6小鼠、IL-10 -/-小鼠、IL-10R2-/-小鼠Rag -/-小鼠和OTII小鼠均購于美國Jackson Lab，飼養于標準SPF級環境。

1.2 抗體及試劑成分 IRF8、IRF5、b-actin，anti-Rabbit、anti-mouse、anti-goat二抗均購于santa cruz technology; 流式抗體IL-12p40-APC、F4/80-PE、NOS2-PE、CD11b-PE、CD11b-FITC購于美國ebioscience公司；CD4-FITC、CD4-PE購于BD公司。CD4分離磁珠購于德國Miltenyi公司。miR-146b 引物(Qiagen)。RAN 免疫共沉淀試劑盒(EMD Millipore)，RIP 試劑盒(EMD Millipore)。組織和細胞DNA 提取試劑盒(Qiagen),RNA 提取試劑盒和逆轉錄試劑盒(Life technology)。1640細胞培養基和DMEM細胞培養基購于Gibco公司。

1.3 質粒 構建質粒所需要的內切酶和相應buffer購于New Egnland Biolab公司。熒光素酶報告載體pmiR-vector report購于life technology。IRF5 siRNA購于Santa Cruz technology。Leti-IRF5由實驗室自行構建。感受態細胞DH5a購于life technology。

1.4 OTII CD4淋巴細胞分離培養

處死OTII小鼠，取腹股溝和腋下淋巴結以及脾臟，制成單細胞懸液，加入30 μl 抗CD4偶聯磁珠(德國，Miltenyi)，冰上孵育30 min，1xPBS洗滌2次，并用磁珠自動分選儀分選，收集CD4陽性的細胞備用。

1.5 骨髓來源巨噬細胞(BMDMS)培養

取WT和IL-10-/-小鼠骨髓，經過淋巴細胞裂解液破壞紅細胞，1 500 rpm/min 離心5 min，以2*106細胞/ml培養基(包含10%FBS、10 ng/ml鼠重組GMCSF)，種植于相應培養板，每隔3天換更換培養基，共培養7天。

取WT和IL-10-/-小鼠骨髓，經過淋巴細胞裂解液破壞紅細胞，1 500 rpm/min離心5 min，以2*106細胞/ml培養基(包含10%FBS、10 ng/ml鼠重組GMCSF)，種植于相應培養板，每隔3天換更換培養基，培養至第5天，轉染miR-146b模擬物，終濃度為1 nm，直到第7天，加入新鮮10%FBS的DMED培養基，并加入100 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ刺激24 h。分離來源于OTII小鼠CD4+T細胞，按照每孔細胞與巨噬細胞混合培養3天。

1.6 流式細胞術

檢測CD4,IL-12/23p40,F4/80,MHC II,IL-17和IFN-γ表達于上述收集的細胞，將細胞均勻分為2管；一管分別加入10 μl的IL-12/23p40-APC、F4/80-PE、MHCII-FITC 4℃，避光孵育1 h；另外一管刺激培養后分別加入10 μl的IL-17-PE、IFN-γ-APC 4℃，避光孵育1 h，1 000 rpm/min，離心5 min，洗去未結合的抗體；重復上一步驟；棄上清，0.4%甲醛PBS 200 μl重懸細胞，于流式細胞儀(BD FACS Arail III)檢測表面分子表達情況，FlowJo 7.6軟件分析數據。

1.7 RNA抽提和qPCR

收集細胞加入1 ml Trizol (invitrogen)溶液，用超聲組織破碎儀勻漿組織室溫靜置5 min；加入200 μl氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，室溫靜置3-5 min；4℃下，14 000 g離心15 min，可見分為3層，RNA在上層水相，移至另一個新的RNase free EP管；沉淀RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置10 min；4℃下，14 000 g離心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗滌兩次(12 000 g離心5 min)，超凈臺風干；視沉淀量加入適量DEPC水(至少15 μl)溶解沉淀。逆轉錄和定量PCR檢測：根據說明書進行。

1.8 李斯特菌感染實驗

10只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組5只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，10只小鼠均通過尾靜脈注射5*104U李斯特菌。觀察48 h后處死小鼠，抽取外周血，留取肝臟和脾臟，一部分用于提取RNA；另一部分分別支撐細胞懸液，按照1/10倍連續稀釋原液，每一個濃度取100 μl均勻涂抹到瓊脂糖培養板，37℃過夜孵育，次日觀察菌落及計數；并檢測相應指標。

1.9 內毒素休克實驗

12只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組6只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只LPS，觀察小鼠生存率。另外，6只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組3只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射200 ng/只 LPS，4 h后，處死小鼠，留取外周血以及脾臟。并檢測相應指標。

1.10 統計學分析 采用 SPSS13.0統計軟件，不同組間表達的差異用非參數Kruskal-Wallis檢驗,生存分析采用Kaplan-Meier分析。所有的統計結果選取檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 miR-146b在WT和IL-10-/-小鼠BMDM中表達結腸組織中的表達情況

miR-146b在WT小鼠BMDM中表達隨著刺激時間增加而增高；但是在IL-10-/-小鼠BMDM中，表達低于WT小鼠BMDM，并不隨刺激時間增加而改變。熒光原位雜交結果顯示miR-146b在巨噬細胞核表達，同時miR-146b在IL-10-/-小鼠BMDMs明顯下降。這些結果提示IL-10調節miR-146b的表達，可能參與巨噬細胞分化(圖1)。

取來源于WT和IL-10-/-骨髓巨噬細胞，采用LSP 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬細胞，采用qPCR(A)和熒光原位雜交(B)檢測miR-146b的表達，U6作為內參照。

圖1 miR-146b在M1型巨噬細胞中的表達

2.2 miR-146b mimic能抑制IL-10-/-M1型巨噬細胞分化

在IL-10-/-巨噬細胞培養到第五天時，轉染miR-146b mimic，繼續培養2天后用LPS和IFN-r刺激，是否miR-146b能調節M1巨噬細胞分化？我們將WT和IL-10-/-骨髓來源巨噬細胞轉染mir-146 b模擬物(mimic)。轉染2天后,細胞在LPS (100 ng/ml)和IFNg(20 ng/ml)聯合刺激下24 h。通過流式細胞儀和ELISA分析結果表明,IL-12 p40+細胞比例在miR-146b模擬物處理組明顯減少(圖2)。同樣,在miR-146b模擬物處理組中，細胞上清中IL-12 p40、TNFa和IL6分泌均顯著下降(圖3)。這些結果表明miR-146 b可以負性調節M1巨噬細胞分化。

2.3 IRF5可以作為miR-146b的靶基因

生物信息學分析認為，人IRF5可以作為miR-146b預測靶點，而人和小鼠miR-146b成熟序列具有高度同源性，我們采用序列對比發現，在小鼠IRF5也存在與人類似的miR-146b結合位點(圖3)，因此，我們推測，在小鼠IRF5也可以作為miR-146b的一個預測位點。為了證實這個假設，我們構建了IRF5 3′UTR端包含miR-146b預測結合位點的熒光素酶報告基因載體及結合位點突變載體 ，將IRF5 3′UTR載體或突變載體與pre-miR-146b共轉染到HEK293細胞，結果顯示IRF5 3′UTR質粒與pre-miR-146b共轉染組熒光強度明顯低于IRF5 3′UTR突變質粒與pre-miR146b共轉染組(圖3)。進一步采用RNA染色體免疫共沉淀技術(RIP)分析認為miR-146b與IRF5mRNA共存于miRISC轉錄復合體中。此外，在IL-10-/-骨髓來源M1巨噬細胞轉染miR146b模擬物48 h后，繼而LPS/IFN-γ刺激48 h，兩組細胞中IRF5表達均明顯下降，同時IL-12 p40+細胞比例和細胞上清IL-12 p40、TNFa和IL6分泌均顯著下降；并且在miR-146b模擬物轉染組同時轉染IRF5過表達質粒能使IL-12 p40+細胞比例和細胞上清IL-12p40、TNFα和IL-6分泌顯著上調(圖3)。這些結果提示了IRF5可以作為miR-146b的靶基因，參與了miR-146b調節M1巨噬細胞分化的信號途徑。

采用LSP 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬細胞，分別轉染miR-146b mimic和Scramble到巨噬細胞中，48 h后采用流式細胞儀檢測CD11b+IL-12p40+細胞比例(A,B);并采用ELISA檢測IL-12 p40、IL-6和TNFa的表達(C),重復3次。

圖2 miR-146b mimic抑制腸道M1型巨噬細胞激活

A,生物信息學分析認為miR-146b與IRF5基因3′UTR區域部分核苷酸匹配。B,構建IFR5基因3′UTR熒光素酶報告基因載體，與miR-146b共同轉染于HEK293T細胞，并檢測熒光。C,采用RIP技術檢測miR-146b與IRF5在抗Ago2抗體復合物中的表達。D,用western blot檢測IRF5表達。F,取來源于WT的IL-10-/-骨髓的巨噬細胞，采用LPS 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬細胞，分別轉染miR-146b mimic和Scramble到巨噬細胞中，6 h后，采用CHIP檢測.E,48 h后采用流式細胞儀檢測CD11b+IL-12p40+細胞比例重復3次

圖3 IRF5是miR-146b的靶基因

2.4 miR-146b mimic 降低了小鼠對李斯特菌的易感性

經尾靜脈注射5*104U李斯特菌感染小鼠，結果發現轉染miR-146b mimic 的小鼠減弱了對李斯特菌的抵抗性；miR-146b mimic轉染組中小鼠肝臟和脾臟表面菌斑明顯多于對照組；但是炎癥相關因子IL12B、TNFa和IL6的表達明顯低于對照組。這說明了miR-146b可能通過抑制巨噬細胞的活性，從而減少炎癥因子釋放，導致對李斯特菌感染的抵抗性減弱(圖4)。

A.10只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組6只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物:70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble:70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只 LPS,A,計算脾臟和肝臟表面的菌落；B,采用ELISA檢測IL-6和TNFa的水平；C,采用熒光免疫組織化學檢測INOS+F4/80+細胞比例。

圖4 miR-146b mimic 阻止李斯特菌感染

2.5 miR-146b mimic 降低了小鼠對內毒素休克的抵抗性

結果顯示miR-146b mimic延長了小鼠在大劑量LPS刺激下的生存時間，并且減少小鼠外周血中IL12B、TNFa和IL6釋放，采用qPCR發現脾臟中IL12B、TNFa和IL6 mRNA表達在miR-146b mimic處理組下降。這說明了miR-146b mimic可能通過巨噬細胞的活性減弱LPS的敏感性(圖5)。

A.12只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組6只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble:70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只 LPS,采用Kaplan-Meier分析小鼠生存率。B，C,qPCR和ELISA分別檢測TNFa、IL-6和IL-12的表達

圖5 miR-146b mimic阻止內毒性休克

3 討論

微小RNA(microRNA)是近幾年新發現的一類(22-24 nt)組成的非編碼小RNA序列，廣泛存在生物體內，在細胞生命進程如進化、細胞增殖以及凋亡等方面發揮至關重要的作用。microRNA通過堿基互補方式綁定其靶基因3′UTRs，抑制靶基因mRNA降解或者阻礙其翻譯，從而降低了靶基因的蛋白表達[12-15]。它們被順序地從由核糖核酸酶III(RNA酶III)Drosa酶和Dicer的轉錄處理，并且它們發揮它們的功能，通過Argonaute(AGO)蛋白組建miRNA誘導沉默復合物(miRISC)，引導microRNA與其靶基因至同一復合體中，miRISC降解或者阻礙靶基因mRNA翻譯成蛋白質[16,17]。越來越多的研究也表明microRNA在機體免疫反應中也起到重要作用，特別是在調節Toll樣受體(TLRs)介導免疫反應的強度和時間的作用及機制方面正吸引著大量科學家的研究興趣[18]。已有研究表明IL-10能抑制TLR誘導的miR-155的表達從而促進抗炎基因的表達[19,20]。

那么，在影響M1巨噬細胞分化過程中，miR-146b是如何作用于M1巨噬細胞相關基因？已有文獻和我們研究認為，轉錄因子干擾素調節因子5(IRF5)被明確認為是M1巨噬細胞分化的關鍵轉錄因子。我們檢測是否IRF5表達能影響IL-10-/-M1巨噬細胞分化？結果顯示WT和IL10-/-骨髓來源M1巨噬細胞LPS (100 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)聯合刺激下，IRF5表達在WT中隨著時間變化而降低，但是在IL10-/-M1巨噬細胞中則保持相對穩定；在IL-10-/-骨髓來源M1巨噬細胞轉染IRF5 siRNA 48小時后，繼而LPS/IFNg刺激48 h，細胞中IRF5表達均明顯下降，同時IL-12 p40+細胞比例和細胞上清IL-12 p40、TNFa和IL-6分泌均顯著下降。這說明了IRF5在IL-10-/-骨髓來源M1巨噬細胞分化過程起到了重要作用。我們也通過RNA免疫共沉淀分析了IRF5和miR-146b在轉錄復合體中的共表達，以及熒光素酶報告基因確認了miR-146b能綁定IRF5的3′UTR靶向序列。這些結果均證實了IRF5可以作為miR-146b調節巨噬細胞分化平衡的一個重要靶向基因。

我們通過體內外實驗檢測了miR-146b在M1型巨噬細胞分化中的影響，通過分離骨髓來源巨噬細胞，在體內證明了miR-146b可以抑制M1型巨噬細胞分化，減少致炎因子TNFa、IL-6、NO等。并進一步通過建立李斯特菌感染模型和內毒素休克模型，證實了miR-146b可以作為調節M1型巨噬細胞分化的一個重要因素。

因此，我們認為在巨噬細胞分化過程中，IL-10誘導miR-146b表達，并通過靶向調節M1型巨噬細胞關鍵因子IRF5，從而調控M1/M2型巨噬細胞分化平衡，控制致炎因子TNF、IL-6、NO等產生，以避免M1型巨噬細胞過度激活而釋放炎癥因子對機體的損傷。

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miR-146b controlled the polarization of M1 type macrophage via targeting IRF5

HUJing-jing,LIKai-xue,LIURuo-dan,etal.

(TheSecondPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzhen518029,China)

Objective To investigate the function of miR-146b in the balance of M1/M2 type macrophage differentiation,we isolated the BMDMs and was stimulated by LPS and IFN-g，and confirmed the M1 type macrophage together with Lister infection and endoxin shock model.Methods BMDMs were isolated and stimulated by GM-CSF from WT and Il-10-/-mice.miR-146b mimic or scramble was transfected in IL-10-/-macrophage.The level of TNF-γ,IL-6 and IL-12 were accessed respectively by qPCR,ELISA or Flow cytometry analysis.miR-146b mimic also was used to treat the Lister infection and endoxin shock model.Results the results showed that miR-146b mimic could obviously inhibit the differentiation of M1 type macrophage,accompany with the decrease of TNFa,IL-6 and IL-12 expression.miR-146b mimic also could enhance the Lister infection by repressing the expression TNFa,IL-6,etc.but could prolong the survival of endoxin shock murine model compared to scramble group.Further,IRF5 was verified to sever as the target gene of miR-146b.Conclusion miR-146b negatively regulated the inflammatory cytokine and inhibited the inflammation.

miR-146b; IRF5;macrophage;BMDMs

1007-4287(2017)06-1076-07

R392

A

2016-12-19)