基于“多基因聚合-早世代組配”策略的水稻分子改良研究

陳立凱，郭 濤，劉永柱，王 慧，陳志強

(華南農業大學 國家植物航天育種工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

基于“多基因聚合-早世代組配”策略的水稻分子改良研究

陳立凱，郭 濤，劉永柱，王 慧，陳志強

(華南農業大學 國家植物航天育種工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

傳統水稻育種技術最主要瓶頸是選擇效率低和周期長。為了提高水稻優異材料選育和雜交稻組配效率，創新水稻分子育種策略，利用分子標記輔助選擇多基因聚合和早世代雜交組配，展開水稻恢復系分子改良和雜交新組合的調查評價。供體親本H318與恢復系親本華占進行雜交，通過選擇和設計關鍵有利基因的分子標記，利用毛細管電泳基因分型技術，將Wxb、fgr、Xa23、Pi2、Pi46以及Pita6個稻米品質、香味、抗白葉枯病和抗稻瘟病相關功能基因進行聚合利用。通過多世代的田間生物學性狀調查，米質、抗性等表型鑒定，獲得14份以恢復系華占為遺傳背景，目標基因純合的優質、雙抗和香型穩定的水稻株系。依據材料穩定遺傳特性，將改良后代株系與生產應用的不育系進行測配和組合的調查評價，篩選獲得潛在優良雜交稻。在育種進程中采用“多基因聚合-早世代組配”策略，實現多個有利基因快速聚合，定向改良稻米品質和抗病性等關鍵性狀，并且促進雜交水稻組合的高效選育。

水稻；分子改良；多基因聚合；雜交組配；恢復系

中國是世界上最大的水稻生產國和消費國，雜交水稻的成功培育，為保障糧食的安全供給做出了巨大貢獻[1]。傳統的育種手段中，對于優良性狀的選擇主要是依賴個體的表現型，選擇效率偏低[2]。近年來，分子輔助選擇(MAS)技術與傳統育種手段相結合，在育種低世代完成標記的輔助選擇過程，大大縮短育種周期[2]。結合水稻傳統育種的技術經驗，充分借助各種新型有效的分子育種技術，從而搭建水稻高效生物育種技術體系，已成為國際水稻育種主流趨勢[3]。不同基因位點的聚合改良受到育種家的普遍推崇[4]，對于多個控制水稻不同優良性狀的基因或QTL同時雜交導入親本受體，實現多個位點有利等位基因的高效聚合，可以達到綜合改良水稻多個重要性狀的育種目標[5-9]。與傳統育種技術比較，分子設計育種能夠實現從“經驗育種”到“定向、高效、精確育種”的轉變[10]。

在雜交育種中，不育系和恢復系的選擇是配置強優勢雜交組合的關鍵環節[11]。以恢復系為著手點，選育高抗稻瘟病的恢復系對于培育抗病優質雜交稻具有重要的意義[12]。周黎軍等[12]研究表明，利用水稻早世代穩定親本進行水稻恢復系的選育在時間和方法上都可能取得重大突破。利用早世代穩定親本作為多基因聚合的快速穩定載體，在雜交后代早世代中發現和獲得穩定株系，并通過分子標記輔助選擇手段檢測恢復性分子標記位點，田間鑒定配合力，是一種恢復系選育的新途徑[12]。

Wx和fgr基因分別調控水稻直鏈淀粉含量和香氣形成[13]。稻米的直鏈淀粉含量是影響稻米食用口感最重要的因素之一，研究表明Wx基因對于稻米直鏈淀粉含量的高低具有決定性的作用[13]。香味是高品質稻米的一個重要特性，香稻因其優良的香味品質為人們所喜愛，在國際稻米市場中占有重要地位，稻香味性狀和香稻育種的研究也日益受到重視。稻米香味性狀育種選擇環節中，最直接有效的是直接對香味基因型進行選擇，香味功能基因的鑒定和功能性分子標記的出現為這種直接選擇提供了可能[14-15]。稻瘟病(PyricutariaoryzaeCav.)和白葉枯病(Xanthomonascampestrispv.oryzae)分別是世界范圍內對水稻生產危害最嚴重的真菌性病害和細菌性病害[16]，給水稻的生產造成極大的危害，嚴重時甚至會造成絕收。實踐證明，在眾多的防治措施中抗病品種的培育和種植是控制該病害最為經濟、安全和有效的方法[8，11，17]。目前已報道的白葉枯抗病基因及稻瘟病抗性基因分別有38，83個[7]。Xa23是已報道對白葉枯抗性最好的基因之一，其對10個菲律賓小種、3個日本小種以及7個中國小種都表現出很好的抗性[7]。Pi46、Pi2和Pita基因是3個顯性廣譜抗稻瘟病基因，對我國各稻區菌株表現廣譜抗性[11，17-19 ]。應用分子標記輔助選擇聚合多個抗性基因，拓寬抗譜，增強抗性，是培育具有持久抗性和綜合抗性品種的有效策略。

本研究提出“多基因聚合-早世代組配”的分子改良策略，通過選擇和設計關鍵有利基因的分子標記，將Wxb、fgr、Xa23、Pi2、Pi46以及Pita6個稻米品質、香味、抗白葉枯病和抗稻瘟病相關功能基因進行聚合改良應用；依據材料穩定遺傳特性，將低世代改良后代株系與生產應用的不育系進行測配。對雜交組合進行調查評價，以期促進優異雜交水稻組合的高效選育。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用水稻材料包括恢復系華占(含Wxb和Pi2基因)和多基因聚合系H318(含Wxb、Xa23、Pi46、Pita以及fgr基因)。2013年以華占為輪回親本進行雜交和回交，展開基因型分析和MAS，獲得改良后代株系。用于組合測配的不育包括三系不育系寧A和兩系不育系C815S。此外，本研究等位基因分型使用的對照樣品包括：H4：Pi46；麗江新團黑谷：pi46；粵豐新占：Wxa、pita及xa23；IR-BB 64：Wxb、Pita及Xa23；象牙香占：fgr及pi2；粵晶絲苗2號：Pi2；航恢173：Fgr、Rf3及Rf4；H4：rf3及rf4。水稻不育系C815S由湖南農業大學提供，其他材料均來自于國家植物航天育種工程技術研究中心種質資源庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻田間種植和農藝、品質性狀調查 水稻種植于國家植物航天育種工程技術研究中心試驗基地(廣州)，田間管理按大田常規栽培要求實施。全生育期觀察田間株葉形態，參考《農作物品種區域試驗技術規范 水稻》(NY/T 1300-2007)，植株成熟后隨機選取3株，調查農藝性狀包括株高、劍葉長、劍葉寬、單株穗重、穗數、實粒數、空粒數、總粒數，十粒長、十粒寬、長寬比，千粒質量等。隨機取整精米100粒，逐粒目測，揀出明顯的白色不透明的堊白米粒，并計數統計堊白粒率；后用堊白度統計軟件計數出堊白度，2次重復。香味測定采用KOH浸泡的感官品評法，參考Jin等[20]的操作步驟。根據農業部部頒標準NY147-88(稻米品質評價方法)測定直鏈淀粉含量，以直鏈淀粉占淀粉總量的百分率表示。

1.2.2 水稻抗病性鑒定 按照廣東農科院植物保護研究所方法培養，接種菌液濃度為9×108個/mL。孕穗期內，參照“剪葉法”進行白葉枯病抗性鑒定，菌株為廣東省優勢致病生理小種Ⅳ型菌。在田間條件下，選取播種60 d后的水稻單株，每株接種4～5片葉。21 d后調查病情，測量病斑長度，并統計分析、分級，3組重復。病情分級按照國際標準0～9級分級。采用自然病圃鑒定稻瘟病抗性。選擇廣東省稻作區的陽江稻瘟病鑒定圃，葉瘟和穗頸瘟的調查按國際水稻研究所的分級標準。

1.2.3 DNA提取和分子標記檢測 取苗期水稻的葉片，參照磁珠法快速提取水稻總DNA[21]，并溶解于1×TE中，用NanoDrop 1000 (Thermo，USA)定量后以超純水稀釋至75 ng/μL，-20 ℃保存。PCR擴增體系含2×PCR Reaction Mix 10 μL(含100 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L MgCl2、400 mmol/L dNTP)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 1 μL，超純水補至20 μL。反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。本研究所用分子標記信息見表1。參照Chen等[21]方法步驟，利用毛細管電泳進行擴增產物的檢測。

表1 分子標記信息

注：引物序列中小寫字母的堿基為引入的錯配堿基;帶下劃線字母的堿基為等位變異堿基。

Note：The bases of lowercase letter in the primer sequences are the introduced mismatch bases;Bases underlined are the allelic variation bases.

2 結果與分析

2.1 基因分型和多基因聚合設計

本研究所利用的分子標記，包括前人已鑒定的目標基因連鎖標記，與廣譜抗稻白葉枯病基因Xa23緊密連鎖的STS標記M-Xa23、與稻瘟病主效抗病基因Pi46緊密連鎖的SSR標記RM224和與稻瘟病抗病基因Pi2連鎖的特異分子標記AP22。同時，利用ARMS-PCR技術[21]，針對水稻蠟質基因Wx功能突變位點(G/T)設計開發了SNP分型標記Wx-GT、稻米香味基因fgr的功能插入缺失位點，開發了InDel分型標記fgr-E7-FM以及稻瘟病抗病基因Pita功能突變位點設計了SNP分型標記Pita-GT。此外，為了輔助育性恢復力性狀的分子篩選，分別引入了2個最主要的恢復基因位點Rf3和Rf4的連鎖標記。上述分子標記的等位分型電泳圖譜如圖1所示。通過基因分析，確認恢復系華占含Wxb和Pi2基因，多基因聚合系H318含Wxb、Xa23、Pi46、Pita以及fgr基因。

橫坐標.PCR產物大小；縱坐標.RFU相對熒光單位。

供體親本H318與恢復系親本華占進行雜交，在F1中去除假雜種后與華占進行回交。2014年晚季種植株BC1F1，利用分子標記fgr-E7-FM、M-Xa23、RM224、AP22、Pita-GT、RM10338和RM6100檢測，確保目標基因位點全部導入，并且同時保留恢復基因位點。隨后，選擇目標基因位點盡多純合、農藝性狀接近輪回親本(華占)的17個單株進行自交收種(表2)。

2015年早季，種植回交后代BC1F2，并繼續展開分子標記篩選。繼而獲得6個目標基因性狀均純化同時保留2個恢復基因位點的株系。結合株葉型進行農藝性狀選擇，共14個株系入選進行自交加代。2015年晚季形成BC1F3株系，田間性狀觀察發現大部分株系整體株葉形態整齊、生育期一致，表明株系內遺傳物質已經較為相似、穩定。據此，對這些株系展開農藝性狀和米質性狀鑒定、抗病性調查和雜交組配，篩選獲得穩定的、農藝性狀優良的多基因聚合改良恢復系材料。整個分子改良過程的育種程序如圖2所示。

2.2 改良恢復系的主要性狀評價

親本材料華占和H318以及多基因純化聚合改良株系的主要稻米品質性狀如表3所示。所有多基因聚合系攜帶親本共有的Wxb等位基因，遺傳其直鏈淀粉含量低-中的優良特性，大部分(64.3%)株系AC值13%～14%，最高值為18.01%，最低值10.05%。受體親本恢復系華占的fgr基因等位類型為野生型，籽粒無香味；利用供體H318導入fgr香味基因，后代改良株系的籽粒均鑒定獲得香味特性，各株系受環境和小部分遺傳背景影響，香氣程度有所差異。粒型方面，改良株系與親本之間的長寬比差異不明顯。但是與恢復系華占相比，大部分改良株系堊白性狀有明顯改善，分別有78.6%和92.9%的株系堊白粒率和堊白度性狀降低，外觀品質得到改良。其中，株系R-19862和R-21064兼備低直鏈淀粉含量、香氣濃以及堊白外觀品質優異的特點，具有較大育種利用價值。

表2 多基因聚合入選回交后代單株及其基因型

注：+.攜帶優異等位基因；H.雜合子。

Note：+.Elite allele； H.Heterozygote.

圖2 “多基因聚合-早世代組配”策略的水稻分子改良簡要流程圖

14份改良株系均攜帶來自供體親本H318的白葉枯病主效抗性基因Xa23，其白葉枯病抗性鑒定結果(BC1F4)如表3所示。除了3份株系未獲得調查結果，其余11份改良株系的抗性級別均為抗，而受體親本華占的白葉枯病抗性水平則鑒定為感。結果表明，導入Xa23基因，能夠高效、一致地提高白葉枯病抗性水平，改良效果顯著。2016年的2個種植季節分別對改良株系(BC1F4和BC1F5)連續進行田間自然誘發病圃的稻瘟病抗性鑒定，結果如表3所示。由表可知，恢復系華占在2016年早季稻瘟病抗性水平為中抗，2016年晚季為抗；供體親本材料H318表現為兩季均表現為抗水平。鑒定結果表明，聚合了3個稻瘟病抗病基因的13個株系抗性水平均表現為抗或高抗，抗性穩定(表3)。與華占比較，改良株系抗性水平表現明顯提高。R-20314和R-20321兩季分別鑒定為抗和高抗；R-21064兩季均鑒定為高抗。通過分子標記輔助選擇技術聚合Pi46、Pi2和Pita基因能有效提高受體親本的稻瘟病抗性，并且抗性水平穩定。

表3 親本品種和改良株系主要米質性狀和抗病性調查

注：AC.直鏈淀粉含量；LWR.長寬比；PGWC.堊白粒率； DEC.堊白度；+.香味；Ⅰ.2016早季；Ⅱ.2016晚季。

Note：AC.Amylose content；LWR.Length-width ratio;PGWC.Percentage of grain with chalkiness； DEC.Degree of endosperm chalkiness;+.Indicates fragrant;Ⅰ.Early season of 2016；Ⅱ.Late season of 2016.

2.3 改良株系組配和雜交組合的表現

根據本研究早世代組配以提高雜交組合選育效率的策略，通過觀察BC1F3和BC1F4株系田間農藝性狀表現，將整體株葉型態趨于一致的改良株系分別與生產上的不育系寧A和C815S進行組配。考察雜交組合F1主要的農藝、品質、產量及經濟性狀，包括株高、單株穗重、有效穗數、結實率、研磨品質和外觀品質等，結果如表4所示。

株高方面，組配的雜交組合與CK相比有正反方向變異波動，寧A所配組合株高增加占主要，而C815S所配組合主要表現株高降低。產量方面，大部分改良株系所配組合在千粒質量上得到改良，特別是與C815S所組配的F1千粒質量均高于CK。寧A/R-19862、C815S/R-20765和C815S/R-21056在總粒重明顯高于CK，分別提高了3.82%，12.48%和15.47%，表明這3個株系具有潛在的優良高產配合力。結實率方面，三系不育系寧A所配組合為68.57%～85.57%。而C815S所配組合則偏低，在58.50%～73.46%。研磨品質調查結果表明，改良株系與C815S雜交F1在精米率和整精米率均得到提高。此外，新的雜交組合在粒型和堊白的外觀品質性狀上獲得不同類型，豐富遺傳多樣性和滿足不同品種選育需求。

3 討論

隨著生物技術的快速發展，分子標記輔助育種在縮短育種年限、提高育種效率等方面發揮了極其重要的作用[10，22-23]。然而，對于MAS改良后代的表型，其預測度一方面取決于基因的效應水平，另一方面和分子標記與目標基因的連鎖程度有直接關聯[21]。有利等位基因的鑒定和選擇，是有效預測評估分子改良成效的前提。本試驗中，蠟質基因Wx編碼顆粒淀粉合成酶(GBSS)，是控制直鏈淀粉合成的主效基因，直接影響稻米胚乳中直鏈淀粉的含量[24]。水稻香味是由于編碼甜菜醛脫氫酶基因突變所致，喪失功能的fgr基因使甜菜醛脫氫酶的作用底物2-乙酰基-1-吡咯啉的代謝途徑中斷，香味物質2-乙酰基-1-吡咯啉不斷積累，致使水稻籽粒產生香味[25]。白葉枯病抗性基因Xa23對現有國內外白葉枯病鑒別菌系都表現高抗，且完全顯性、全生育期抗病[26-27]。而Pi2、Pi46和Pita均為具廣譜抗性的稻瘟病顯性抗性基因，抗性都較好，已被廣泛驗證和利用[8-9，11，18-19]。此外，本研究設計Wx、fgr和Pita基因的分子標記，直接靶向基因內部多態性位點，實現直接對目的基因的選擇。基于此，低世代材料并未進行稻米品質和抗病性篩選，僅利用分子標記選擇目標基因，結合農藝性狀進行選擇。在較高代穩定株系中進行米質、香味和抗病性鑒定，獲得多份同時具備雙抗、低支鏈淀粉含量的香型恢復系材料，所利用的基因和分子標記體現出MAS的精準性和高效率。

表4 改良株系雜交組配F1的主要農藝性狀表現

注：CMS line.細胞質雄性不育系；PH.株高；PWPP.單株穗重；PNPP.單株穗數；TGW.總粒重；KGW.千粒質量；SR.結實率；BRR.糙米率；MRY.精米率；HRY.整精米率；GL.粒長；GW.粒寬；LWR.長寬比；PGWC.堊白粒率；DEC.堊白度。

Note： CMS line.Cytoplasmic male-sterile line; PH.Plant height;PWPP.Panicles weight per plant; PNPP.Panicles number per plant; TGW.Total grain weight; KGW.1000 grain weight; SR.Seed setting rate; BRR.Brown rice rate;MRY.Milled rice rate; HRY.Head rice yield; GL.Grain length; GW.Grain width;LWR.Length-width ratio; PGWC.Percentage of grain with chalkiness; DEC.Degree of endosperm chalkiness.

多基因聚合在水稻綜合性狀分子改良中具有無以比擬的優勢。田大剛等[7]將Pi9和Xa23聚合導入雜交水稻恢復系閩恢3189、閩恢3229和閩恢6118，獲得兼抗稻瘟病和白葉枯病的水稻恢復系分子改良系。姜潔鋒[6]利用MAS將抗稻瘟病基因Pi2和抗白葉枯病基因Xa7、Xa21和Xa23滲入到3個優良的水稻光溫敏核不育系C815S、廣占63-4S和華328S背景中，創建了一系列抗病性得到明顯改良的光溫敏核不育系新材料。肖武名等[18]通過MAS將Pi46與Xa23展開有效聚合，實現了創制雙抗水稻種質的目的。本研究結果表明，廣譜白葉枯病抗性基因Xa23的導入明顯提高了水稻分子改良系的白葉枯病抗性，抗性鑒定結果都達到了抗級水平。而3個稻瘟病抗性基因Pi2、Pi46和Pita的同時聚合，使得改良株系表現出更強、更持久的抗病性。連同Wx和fgr基因，共6個功能基因的MAS聚合效果顯著，這些分子改良系有望升級原有親本，在生產中具有良好應用前景。

對于早世代穩定改良株系，利用恢復基因分子標記輔助選擇恢復力性狀，結合田間鑒定配合力，可提高雜交組合選育效率，促進育種進程。目前，已通過本研究獲得一批BC1F6的綜合性狀優良、穩定的株系及其雜交組合。其中R-19862、R-21064、R-19913、R-20765和R-21056入選新雙抗和低直鏈淀粉含量的香型恢復系，展開大規模組配和育種利用。綜上可知，充分利用分子標記輔助選擇，多基因聚合分子改良選育穩定優異株系，結合早世代田間觀察，同時開展多個性狀的鑒定評價和雜交組配，進而可快速、準確的選育出綜合性狀優良的新的改良株系和雜交組合。

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Molecular Improvement Based on the Strategy of ′Multiple Genes Pyramiding-early-generation Hybridized Combination′ in Rice

CHEN Likai，GUO Tao，LIU Yongzhu，WANG Hui，CHEN Zhiqiang

(National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Low selection-efficient and long cycle are the main bottle necks of conventional breeding technique.In order to make improvement of the efficiency of variety breeding and hybridized-combination，we innovated the molecular breeding strategy in rice.Then we carried out molecular improvement of restorer line and evaluation of new hybrid combination by multiple genes pyramiding and early-generation hybridized combination.The donor parent H318 was hybridized with restorer parent Huazhan，and we constructed the multiple genes pyramiding technology by selection and design molecular markers，and performed pyramiding-improvement application with 6 functional genes for grain quality，fragrance，and disease resistance，includingWxb，fgr，Xa23，Pi2，Pi46，andPita.As the result，we achieved a series of 14 stable rice lines with genetic background of restorer line Huazhan，homozygous target-genes，and high grain-quality，double-resistant，and fragrance.In accordance with stable-inheritance properties，ideas of early-generation hybridized combination was raised.Test cross of improved lines with CMS lines in production practice of NingA and C815S were carried out，and performance of new hybrid combination was evaluated，therefore，potential superior hybrid rice was screened and achieved.In this study，breeding programs adopted the strategy of multiple genes pyramiding-early-generation hybridized combination，this method could realize the quick pyramiding of multiple favorable genes，targeted improvement of key traits of grain quality and disease-resistant，promotion of high-efficiency breeding of hybrid rice.

Rice； Molecular improvement； Genes pyramiding； Hybridized combination； Restorer line

2017-04-21

國家高技術研究發展計劃“863計劃”項目(2016YFD0102102)；廣東省科技計劃項目(2015B02031011)；國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-01-12)

陳立凱(1986-)，男，廣東汕頭人，博士，主要從事植物遺傳和分子生物學研究。

陳志強(1956-)，男，廣東揭陽人，教授，碩士，主要從事水稻遺傳育種相關研究。 郭 濤(1978-)，男，河南駐馬店人，教授，博士，主要從事水稻遺傳育種相關研究。

S435.1；S511.03

A

1000-7091(2017)03-0077-08

10.7668/hbnxb.2017.03.012