基于高通量測序的一個非綜合征型耳聾家系遺傳性分析

趙勝瑜 耿曼英△ 王利利 湯文學 趙九州 王志中 張 慧 郭景玉

1)鄭州大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科 鄭州 450014 2)鄭州大學附屬腫瘤醫院分子病理實驗室 鄭州 450000

基于高通量測序的一個非綜合征型耳聾家系遺傳性分析

趙勝瑜1)耿曼英1)△王利利1)湯文學1)趙九州2)王志中2 )張 慧1)郭景玉1)

1)鄭州大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科 鄭州 450014 2)鄭州大學附屬腫瘤醫院分子病理實驗室 鄭州 450000

目的 采用高通量測序方法對一個非綜合征型耳聾(non-syndromic hearing loss，NSHL)家系進行基因測序，探討該家系的分子遺傳學機制。方法 調查該耳聾家系成員的病史并進行相應檢查，抽取外周血并提取DNA，用高通量測序方法對129個已知的與綜合征型耳聾及非綜合征型耳聾相關的基因進行測序，經計算機分析系統進行堿基讀取，獲得DNA序列。結果 該非綜合征型耳聾家系中3例患者均攜帶GJB3 c.375C>T雜合突變、KCNQ4 c.777T>C雜合突變、ILDR1 c.1545T>G純合突變、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T純合突變、線粒體DNA m.1121T>C突變，Ⅱ6攜帶ILDR1 c.1545T>G雜合突變、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T純合突變，Ⅰ3攜帶GJB2 c.1277C>T純合突變，Ⅱ3、Ⅱ7、Ⅱ11均攜帶GJB2 c.1277C>T雜合突變。結論 該非綜合征型耳聾家系的致病基因可能為線粒體DNA m.1121T>C突變，也可能為GJB2與GJB3雙基因致聾。

非綜合征型耳聾；高通量測序；遺傳分析

耳聾作為最常見的感覺缺陷性疾病之一為人類所熟知，新生兒中聽力損失≥40 dB HL的發病率為1∶1 000，且有約相同數目的兒童在成長過程中發展為耳聾[1]。2006年我國第2次殘疾人抽樣調查顯示；聽力言語殘疾者達2 780萬人，居各類殘疾之首[2]。耳聾的病因可歸納為遺傳和環境兩大類，遺傳性因素占60%以上，其中70%以上屬于非綜合征型耳聾(non-syndromic hearing loss，NSHL)[3]。根據遺傳方式的不同可將遺傳性耳聾分為以下4種：常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、性染色體連鎖(X連鎖隱性遺傳和Y-連鎖遺傳)及線粒體突變母系遺傳[4]。NSHL通常為感音神經性聾，15%～20%為常染色體顯性聾，80%為常染色體隱性聾，1%為X-連鎖耳聾，而線粒體性聾不足1%[5]。線粒體DNA(mitochondria DNA，mtDNA)突變率高，損傷修復能力較差，且mtDNA突變與臨床多種疾病相關，因此吸引眾多學者對mtDNA突變所導致耳聾的研究。本研究應用高通量測序方法對一個NSHL家系進行129個已知的與耳聾相關的基因(http：//www.otogenetics.com)測序，結果顯示，該NSHL家系成員攜帶多種基因的同義突變，而3例患者除攜帶有多種常見突變外，還攜帶mtDNA m.1121T>C，考慮mtDNA m.1121T>C可能為致病基因，或其耳聾為多基因聯合致病。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 收集來自河南南陽市的1個NSHL家系，繪制家系圖(圖1)。本研究所采集信息及血樣均征得患者及家屬同意并簽署知情同意書。所有納入研究的人員均填寫基本信息登記表，詳細調查耳聾患者的發病年齡、誘發因素、伴隨癥狀、耳聾的進展情況、有無耳毒性藥物應用史、頭部或耳部外傷史、噪聲接觸史、母親孕育情況及新生兒黃疸史等。所有納入研究的人員均進行相應檢查，包括純音測聽、聲導抗、耳聲發射、聽性腦干反應、聽覺誘發電位、顳骨CT、頭顱MRI、內聽道水成像等，排除顱腦占位性病變及智力障礙。

圖1 耳聾家系主要成員

1．2 研究方法

1．2．1 標本采集：采集所有納入研究人員的外周靜脈血5 mL，EDTA-K2抗凝。

1．2．2 DNA提取：應用DNA提取試劑盒(購自蘇州云泰生物醫藥科技有限公司)提取DNA，提取方法及步驟嚴格參照試劑盒提供的說明書進行，Qubit dsDNA HS定量待建庫樣本，樣本純度A(260 nm/280 nm)為1.7～2.0，調整投入量/投入體積至80 ng/2 μL。 保存于-20 ℃冰箱備用。

1．2．3 DNA文庫建立：將樣本基因組DNA隨機打斷成200～300 bp的DNA片段，在所獲得的DNA片段兩端分別接上已知序列的接頭構建雜交文庫。純化后進行PCR富集(PCR反應體系及反應程序分別見表1、表2)，將降至室溫的DNA反應產物再次進行純化。Qubit dsDNA HS準確定量所獲得的文庫總量，總量500～750 ng。

表1 PCR反應體系

表2 PCR反應程序

1．2．4 雜交捕獲：將文庫DNA與雜交探針(雜交探針試劑配制見表3，由Otogenetics corporation提供)混勻在PCR儀上反應后用帶有鏈霉素的磁珠捕獲，經洗滌后在DNA片段兩端添加已知序列的Index(由Otogenetics corporation提供)，經PCR擴增后純化得到雙Index文庫。Qubit dsDNA HS法準確定量所獲得的雙Index文庫。

表3 雜交探針試劑配制

1．2．5 上機測序：稀釋文庫DNA至8 pM，加入已準備好的Flow cell中，應用Illumina next 500平臺測序。

1．2．6 堿基讀取：原始圖像文件經計算機分析系統進行堿基讀取，獲得DNA序列。 以上實驗過程均在鄭州大學附屬腫瘤醫院分子病理實驗室完成。

2 結果

2．1 病史及聽力學檢查 本研究中所收集的耳聾家系來自河南省南陽市，先證者Ⅱ548歲，無言語能力，5歲時無明顯誘因突發雙耳聽力下降，現已發展為極重度感音神經性耳聾，純音測聽結果示，雙耳極重度感音神經性耳聾，聲導抗無異常，耳聲發射雙耳未通過。患者Ⅲ44歲，Ⅲ52歲，家長發現患兒8月齡時對聲音無反應就診，Ⅲ4聽覺誘發電位示V波閾值：左耳100 dB，右耳95 dB。Ⅲ5聽覺誘發電位示V波閾值：雙耳均為95 dB。二者耳聲發射雙耳均未通過。余成員相關聽力學檢查未見異常。所有成員均否認頭部及耳部外傷史、耳毒性藥物應用史、噪聲接觸史、新生兒黃疸。

2．2 影像學檢查 所有家系成員顳骨CT、頭顱MRI、內聽道水成像均未見顱內占位、外耳、中耳、內耳等結構異常表現。

2．3 基因檢測 測序結果與http：//genome.ucsc.edu/，參考版本GRch37/hg19進行比對后發現3例患者均攜帶GJB3 c.375C>T雜合突變、KCNQ4 c.777T>C雜合突變、ILDR1 c.1545T>G純合突變、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T純合突變、mtDNA m.1121T>C突變，Ⅱ6攜帶ILDR1 c.1545T>G雜合突變、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T純合突變，Ⅰ3攜帶GJB2 c.1277C>T純合突變，Ⅱ3、Ⅱ7、Ⅱ11均攜帶GJB2 c.1277C>T雜合突變。

3 討論

根據圖1及遺傳規律分析該家系的遺傳方式可能為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳或線粒體突變母系遺傳，因此，基因分析對于明確該家系的致病基因、確定遺傳方式至關重要。目前已知的與耳聾相關的基因數目多達100余種，常用的基因檢測方法有Sanger測序、基因芯片測序、高通量測序。Sanger測序被認為是診斷基因突變的金標準，準確性高，能提供被檢測基因的全部序列信息，但無法同時檢測多個基因多個突變位點，存在成本高、耗時長等缺點。基因芯片測序法可以同時檢測多個基因，但目前已開發的遺傳性聾基因診斷芯片，僅能同時檢測個別常見耳聾基因中的突變，無法檢測少見或未知的突變，存在漏診風險。高通量測序具有快速、準確、靈敏、高效、覆蓋度廣等特點[6-7]。因此，我們選擇高通量測序方法，并應用美國Otogenetics corporation的試劑盒，該試劑盒可對129個已知的與綜合征型耳聾及非綜合征型耳聾相關的基因進行測序。

國內大規模耳聾分子流行病學研究顯示，國人非綜合型耳聾多由GJB2、SLC26A4、12SrRNA、GJB3等基因突變引起[8]。該家系成員除攜帶有常見的GJB2、GJB3突變外，還發現有KCNQ4、ILDR1及mtDNA突變，未發現SLC26A4突變。根據https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/網站數據可知GJB3 c.375C>T、KCNQ4 c.777T>C、ILDR1 c.1545T>G、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T均為同義突變，堿基發生改變后所翻譯的氨基酸未發生改變，因此，以上基因不存在單獨致病性。mtDNA m.1121T>C未見報道。

Liu等[9]曾提出GJB2基因與GJB3基因可能以雙基因模式遺傳共同致聾的觀點，他們認為GJB2與GJB3雖不在同一染色體上，但都編碼縫隙連接蛋白，在內耳離子平衡中發揮重要作用，但具體機制尚未明確。本研究中發現除3例患者同時攜帶GJB2和GJB3突變基因外，其余家系成員不攜帶或只攜帶單一基因突變，因此，該家系有可能為GJB2與GJB3雙基因共同致聾，具體機制有待進一步研究。

線粒體DNA突變是導致耳聾的重要原因之一。目前研究明確的有mtDNA m.1555A>G突變及m.1494C>T突變，此突變位于線粒體核糖體小亞基(12SrRNA)的氨基酸結合位，也是氨基糖苷類抗生素(Aminoglycoside antibiotics，Aman)的作用位點，突變后12SrRNA更易結合Aman，導致耳聾的發生[4]。此外，Lu等[10]研究發現了其他可能與Aman相關的突變位點，包括mtDNA m.745A>G、m.792C>T、m.801A>G、m.839A>G、m.856A>G、m.1027A>G、m.1192C>T、m.1310C>T、m.1331A>G、m.1374A>G、m.1452T>C等，這些突變位點均位于線粒體12SrRNA高度保守的核苷酸上，且在449個正常對照者中未出現以上突變。

本研究發現，3例耳聾患者攜帶mtDNA m.1121 T>C突變，該位點位于線粒體12S rRNA高度保守的核苷酸上，與Lu等[10]發現的m.1027A>G、m.1192C>T相鄰，且在同一功能區，因此該位點可能是與Aman相關的突變位點。雖該家系否認有Aman應用史，但Guan[11]及Goto等[12]的研究顯示，在未應用Aman的家系中也可能出現遲發性或漸進性耳聾，使用Aman后可誘發或加重耳聾表現。因此，我們推測mtDNA m.1121T>C突變可能為該家系的致病基因。但其機制并不明確，需更為廣泛和深入的研究。我們的團隊將繼續跟蹤調查該NSHL家系，并深入研究mtDNA m.1121T>C突變引起耳聾的具體致病機制。

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(收稿2017-01-12)

河南省科技攻關計劃普通項目(No：20130384)

R764.43

A

1673-5110(2017)10-0044-03

△通訊作者：耿曼英，E-mail：manying66@126.com