咖啡因通過Caspase通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的研究

劉寒旸, 宋 軍, 周 艷, 湯黎明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 胃腸病中心, 江蘇 常州, 213000)

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咖啡因通過Caspase通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的研究

劉寒旸, 宋 軍, 周 艷, 湯黎明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 胃腸病中心, 江蘇 常州, 213000)

目的 探討咖啡因?qū)τ谖赴┘?xì)胞的抑制效果及作用機(jī)制。方法 本研究預(yù)設(shè)了分組和藥物處理濃度，采用細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)了胃癌細(xì)胞株的增殖活力，利用流式細(xì)胞儀分析胃癌細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞周期情況，通過目的基因擴(kuò)增法(PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)的基因和蛋白。結(jié)果 咖啡因處理后顯著抑制了胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和生存活力，并且通過Caspase-9/-3通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 咖啡因處理能有效促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。

咖啡因; 胃癌; 凋亡; Caspase

胃癌是世界上十大惡性腫瘤之一，具有較高的癌癥相關(guān)死亡率。在亞洲，胃癌占新發(fā)癌癥病例的約60%[1]。胃癌發(fā)生機(jī)制研究[2]顯示，一些已知的通路如wnt/β-catenin, NF-κB和PI3K/Akt等，這些通路受到復(fù)雜的調(diào)控，在胃癌發(fā)生的不同環(huán)節(jié)起作用。作為凋亡的直接效應(yīng)蛋白, Caspase-9是細(xì)胞自身凋亡通路中的關(guān)鍵一環(huán)。Caspase-9激活成為具有活性的剪切形式，并激活下游家族Caspase-3的形成活性剪切體，直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3]。咖啡因是一種甲基黃嘌呤衍生物，流行病學(xué)調(diào)查和基礎(chǔ)研究[4-7]報(bào)道了咖啡因在抗癌中的潛在作用，在一些組織器官(卵巢，乳腺，肝臟，大腦等)中，咖啡因通過影響或調(diào)控腫瘤相關(guān)通路蛋白PTEN、PI3K/Akt、p53和mTOR等來抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡。僅有極少數(shù)的研究[8-9]認(rèn)為Caspase家族蛋白，尤其是Caspase-9和Caspase-3在咖啡因抑癌過程中起到重要作用。本研究探討濃度梯度下的咖啡因?qū)Π┘?xì)胞的增殖、凋亡的作用效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

咖啡因購(gòu)于Sigma公司(美國(guó))，胎牛血清(FBS)和無血清培養(yǎng)基(1640)購(gòu)于Gibco公司(美國(guó))。流式細(xì)胞試劑盒購(gòu)于BD Biosciences(美國(guó))。總RNA提取試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于Takara(大連)。Z-LEHD-FMK(Caspase-9特異性抑制劑)、Z-DEVD-FMK (Caspase-3特異性抑制劑)購(gòu)于Biovision(美國(guó))。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CK8)購(gòu)于Dojindo(日本)。蛋白免疫印跡人抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology(美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人類正常胃黏膜細(xì)胞株 GES-1, 胃腺癌細(xì)胞株 MGC-803, SGC-7901購(gòu)自中科院上海細(xì)胞典藏庫(kù)。在含10%胎牛血清，青霉素(1×105)和鏈霉素(100 mg/L)的1640培養(yǎng)基, 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)常規(guī)3～4 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)和克隆形成實(shí)驗(yàn)

將待測(cè)的胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901消化后用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化并獲取單細(xì)胞懸液。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10 000 個(gè)/ml, 以 200 μL/孔接種至 96 孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。達(dá)到預(yù)設(shè)的時(shí)間后，每孔加入20 μL的CCK-8試劑和200 μL完全培養(yǎng)基。酶標(biāo)儀中選擇490 mm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度值，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

細(xì)胞用胰酶消化, 4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次, Binding Buffer洗滌1次, Binding Buffer和annexin V的混合液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育15 min, Binding Buffer洗滌1次, Binding Buffer和PI的混合液重懸細(xì)胞, 25 ℃避光孵育15 min,每次洗滌或染劑孵育前均經(jīng)過1 000 r/min離心。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)并分析，以annexin V+/PI-象限的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，記錄并計(jì)算比例。細(xì)胞用胰酶消化, 4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，加入細(xì)胞周期染劑，室溫避光孵育20 min, Buffer洗滌1次。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)并分析G1、S和G2期的比例。

1.5 蛋白提取和Western blot檢測(cè)

胃癌細(xì)胞加入Western及IP細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)法檢測(cè)并調(diào)節(jié)蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉緩沖液(含5%脫脂奶粉TTBS)封閉，按照適當(dāng)濃度(工作濃度為1∶1000), 孵育一抗4 ℃過夜, TBST多次漂洗后孵育二抗(工作濃度為1∶2 000), 暗室曝光。記錄并分析蛋白條帶結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 咖啡因?qū)ξ赴┘?xì)胞株的生長(zhǎng)和增殖的抑制作用存在濃度依賴性

用預(yù)設(shè)濃度0.5、1、2、4和8 mmol/L的咖啡因處理MGC-803和SGC-7901細(xì)胞，設(shè)置未用藥處理的胃癌細(xì)胞株作為空白對(duì)照組。本研究還設(shè)置了5-氟尿嘧啶(5-FU)處理組來評(píng)估咖啡因的作用效果，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。檢測(cè)細(xì)胞增殖水平，圖1結(jié)果顯示在2株胃癌細(xì)胞中，咖啡因處理24 h后細(xì)胞活力和增殖水平下降。在藥物濃度達(dá)到4 mmol/L及以上(4、8 mmol/L)時(shí)，2株胃癌細(xì)胞的增殖率下降到了50%以下。作者對(duì)比5-氟尿嘧啶處理組，以半最大濃度抑制量(IC50)濃度為基準(zhǔn)，選取0～2 mmol/L濃度區(qū)間(1、2 mmol/L)為實(shí)驗(yàn)濃度, 2 mmol/L為有效抑制濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，咖啡因能夠有效抑制胃癌細(xì)胞株(MGC-803和SGC-7901)的增殖水平。此外，咖啡因的抑制作用存在濃度依賴。

2.2 咖啡因能抑制細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡

本研究使用了流式細(xì)胞學(xué)和蛋白免疫印跡的檢測(cè)方法，檢測(cè)胃癌細(xì)胞的凋亡水平和細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比咖啡因處理胃癌細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞數(shù)量比例增加而S期細(xì)胞數(shù)量比例減少。另外，用藥組之間的G0/G1期和S期的細(xì)胞數(shù)量比例差異較小，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛋白免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白(p21、Cyclin D1和CDK4), 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比2株胃癌細(xì)胞在咖啡因(2 mmol/L)處理后p21蛋白水平出現(xiàn)了上調(diào)而Cyclin D1蛋白水平出現(xiàn)下調(diào)，而CDK4表達(dá)水平變化不顯著。胃癌細(xì)胞株尤其是SGC-7901在咖啡因處理后凋亡水平得到了上調(diào)，早期凋亡區(qū)間細(xì)胞數(shù)比例隨著藥物濃度而上升。此外，五氟尿嘧啶(5-FU)處理組胃癌細(xì)胞的凋亡水平與2 mmol/L咖啡因處理組結(jié)果高度類似。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，咖啡因能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞株細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)也升高了胃癌細(xì)胞株的凋亡水平。進(jìn)一步說明了咖啡因潛在的抑癌作用。

圖1 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示咖啡因抑制胃癌細(xì)胞株增殖

2.3 咖啡因通過激活Caspase-9/-3通路介導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞學(xué)的結(jié)果初步證明了咖啡因?qū)ξ赴┘?xì)胞的抑制作用，本研究進(jìn)一步探索抑癌作用和細(xì)胞凋亡的機(jī)制。本研究通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡高度相關(guān)的Caspase家族效應(yīng)的Caspase-9/-3及上游凋亡相關(guān)家族蛋白(Bcl-2, Bad和Bax等)。咖啡因能激活胃癌細(xì)胞Caspase-9/-3的激活形式(Cleaved-Caspase-9/3)以及Cyt-c的表達(dá)量。此外，促凋亡家族蛋白的表達(dá)也被咖啡因的影響，與空白對(duì)照組相比, Bcl-2表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)而Bax表達(dá)量上調(diào)，而Bad的表達(dá)量變化無明顯差異。而對(duì)比同細(xì)胞株的不同濃度組，上述蛋白表達(dá)量變化在相對(duì)高濃度咖啡因(2 mmol/L)處理組較為明顯。本研究引入Caspase-9和Caspase-3特異性抑制劑 Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK, 進(jìn)一步驗(yàn)證咖啡因介導(dǎo)凋亡的機(jī)制通路，結(jié)果顯示，對(duì)比空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的細(xì)胞增殖水平, Caspase特異性抑制劑的處理一定程度上反轉(zhuǎn)了咖啡因抑制增殖的作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，咖啡因尤其是有效劑量濃度(2 mmol/L)能顯著影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，而Caspase-9/3相關(guān)通路在咖啡因抑癌中起關(guān)鍵作用。

3 討 論

咖啡因具有神經(jīng)激動(dòng)作用，其能提高機(jī)體的警覺性、興奮性，促進(jìn)機(jī)體覺醒和保持清醒，還能增強(qiáng)認(rèn)知能力和疼痛耐受力等[10]。除了這些瞬時(shí)效應(yīng)，最近的一些報(bào)道[11]強(qiáng)調(diào)，咖啡因攝入具有許多長(zhǎng)期的積極的神經(jīng)作用，如預(yù)防老年性癡呆的發(fā)展和認(rèn)知能力下降，改善阿爾茨海默病和帕金森病患者的疾病進(jìn)展[12-13]。此外，咖啡因通過抑制磷酸二酯酶(PDE)活性增加cAMP水平，運(yùn)動(dòng)員經(jīng)常通過大量攝入咖啡因來改善身體機(jī)能和降低體質(zhì)量[14]。薈萃分析和前瞻性研究[15- 16]表明，長(zhǎng)期定量攝入咖啡因可以降低2型糖尿病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。咖啡因能通過調(diào)節(jié)血糖水平、體內(nèi)胰島素-血糖平衡、胰島細(xì)胞炎癥和炎性介質(zhì)來降低2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)[17]。此外還有報(bào)道說明，咖啡因通過抑制腫瘤發(fā)生，腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移來起到潛在的抗癌作用。相關(guān)的回顧性和前瞻性研究[18-19]表明，長(zhǎng)期的攝入含咖啡因的咖啡能降低癌癥發(fā)病率和死亡率。

本研究論證了咖啡因處理能抑制胃癌細(xì)胞(MGC-803和SGC-7901)的生長(zhǎng)并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。咖啡因在體外胃癌細(xì)胞系中展現(xiàn)了抗癌的效果，這一效果存在濃度依賴性(尤其在藥物濃度大于1 mmol/L時(shí))和時(shí)間相關(guān)性[20-21]。本研究檢測(cè)了咖啡因處理后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞周期是細(xì)胞持續(xù)不間斷的增殖活動(dòng)必要過程，細(xì)胞周期主要受Cyclin-CDK復(fù)合物調(diào)控，這一復(fù)合物包含了p21 CDK相關(guān)蛋白(CIP1)、激酶抑制蛋白(Kips: p27 KIP1, p57 KIP2)和CDK4抑制因子 (INK4s: p16 INK4a, p15 INK4b, p18 INK4c, p19 INK4d)等。細(xì)胞周期G1期是細(xì)胞可以響應(yīng)胞外信號(hào)的時(shí)期，細(xì)胞的增殖程度取決于增殖性和抗增殖信號(hào)的平衡。本研究中，咖啡因?qū)⑽赴┘?xì)胞MGC-803和SGC-7901細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，調(diào)控了Cyclin-CDK復(fù)合物的蛋白表達(dá)量，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了咖啡因通過影響細(xì)胞增殖內(nèi)部機(jī)制而非直接殺傷細(xì)胞來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)咖啡因影響了Bcl-2、Bax、Cyt-c以及下游Caspase-9/-3(激活形式)的表達(dá)，以此產(chǎn)生了促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2、Bax是凋亡相關(guān)因子家族成員, Cyt-c是細(xì)胞經(jīng)典能量代謝中的關(guān)鍵因子，它們可以調(diào)控下游的Caspase家族蛋白并促進(jìn)激活形式的生成，直接加速細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

本研究就咖啡因?qū)ξ赴┘?xì)胞的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作了一定的研究，論證了咖啡因潛在的抗癌作用。藥物的劑量控制是平衡藥效和安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究也關(guān)注了咖啡因劑量問題，作為藥物或食品攝入達(dá)到穩(wěn)定有效的作用的同時(shí)，也不能超過機(jī)體能耐受的最大劑量。本研究根據(jù)濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取了1 mmol/L和2 mmol/L濃度作為研究濃度，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)濃度咖啡因處理胃癌細(xì)胞無論對(duì)于細(xì)胞表型或是蛋白基因的表達(dá)都存在作用(尤其是2 mmol/L濃度)，同時(shí)這樣的濃度選擇也避免了實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株由于藥物毒性或者理化性質(zhì)而直接死亡。根據(jù)相關(guān)基礎(chǔ)研究[22-23]報(bào)道, 1～2 mmol/L的體液濃度量咖啡因相當(dāng)于每日攝入1～2杯正常咖啡因含量咖啡的攝入。如果咖啡因作為癌癥預(yù)防性長(zhǎng)期攝入，除了咖啡因無法耐受的或是神經(jīng)、心血管疾病的人群，這一攝入劑量能夠被廣泛接受，存在臨床使用的可行性。

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Caffeine promotes apoptosis of gastric cancer by Caspase pathway

LIU Hanyang, SONG Jun, ZHOU Yan, TANG Liming

(CenterforGastrointestinalDisease,ChangzhouSecondPeople′sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213000)

Objective To investigate anti-cancer effects and mechanism of caffeine on promoting apoptosis of gastric cancer. Methods The viability and proliferation of gastric cancer cells were evaluated by harvesting and counting cells at preset time points after treatment with specific concentrations of caffeine. Flow cytometry was performed to assess cell cycle dynamics and apoptosis. Western blot analysis was used to detect the activity of the above signalling pathway. Results Caffeine treatment significantly suppressed GC cell growth and viability and induced apoptosis by enhancing the Caspase-9/3 pathway. Conclusion Caffeine can effectively promote the apoptosis of gastric cancer cells.

caffeine; gastric cancer; apoptosis; Caspase

2017-02-26

湯黎明, E-mail: 1315513977@qq.com

R 735.2

A

1672-2353(2017)13-040-05

10.7619/jcmp.201713011