上皮性卵巢癌組織中miR-21-5p、miR-29-3p、miR-139-5p表達變化及意義

崔開穎，趙素芬，朱根海

(1海南省人民醫院，海口570000；2河北醫科大學第二附屬醫院)

上皮性卵巢癌組織中miR-21-5p、miR-29-3p、miR-139-5p表達變化及意義

崔開穎1，趙素芬2，朱根海1

(1海南省人民醫院，海口570000；2河北醫科大學第二附屬醫院)

目的 觀察上皮性卵巢癌(EOC)組織中miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p的表達變化，并探討其臨床意義。方法 收集卵巢組織標本182例，其中正常卵巢組織56例、良性上皮性腫瘤(BEOT)42例、EOC 84例。采用實時熒光定量PCR技術測定組織標本中的miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p，并分析其與EOC患者臨床病理特征的關系。結果 與正常卵巢組織、BEOT組織相比，EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p相對表達量增加， miR-139-5p相對表達量降低(P均<0.05)；正常卵巢組織與BEOT組織比較，差異無統計學意義。與中高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的EOC組織相比，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的EOC組織miR-21-5p和miR-29-3p高表達者多，miR-139-5p高表達者少(P均<0.05)。結論 EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p表達上調并可能發揮促癌作用，miR-139-5p表達下調并可能具有一定抑癌作用，三者均可作為EOC的預后指標或者治療靶標。

微小RNA-21-5p；微小RNA-29-3p；微小RNA-139-5p；上皮性卵巢癌

上皮性卵巢癌(EOC)在卵巢癌中最為多見，其病死率位居所有婦科腫瘤的首位[1]。目前，盡管卵巢癌發生和發展機制的相關研究取得較大進展，然而，還有很多機制尚待闡明，新的治療理論、策略和方法尚需進一步探索。微小RNAs(miRNAs)是一類長度約為21個核苷酸組成的RNA小分子，通過特異性靶向降解目標mRNA分子或者抑制目標蛋白翻譯過程而發揮廣泛的生物學作用[2]。miRNAs在腫瘤發生、發展、耐藥和預后中均具有重要作用，是腫瘤研究領域的熱點分子之一[3]。miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p均是人體細胞生長和增殖調節的重要miRNAs，目前關于這些miRNAs在EOC組織中的研究鮮見報道。本研究通過觀察miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p在EOC中的表達情況并探討其臨床意義，旨在為EOC的診斷和治療新策略開發提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2015年10月海南省人民醫院接受手術治療的182例婦科患者卵巢組織標本，其中因良性宮體病變而切除附件的正常卵巢上皮組織標本56例，良性上皮性卵巢腫瘤(BEOT)組織標本42例，未經放、化療而手術切除的EOC組織標本84例。EOC患者年齡<50歲26例，≥50歲58例；病理類型：漿液性48例，黏液性20例，子宮內膜樣8例，透明細胞癌8例；分化程度：低分化33例，中分化36，高分化15例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期54例；無淋巴結轉移27例，有淋巴結轉移57例。

1.2 miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。紫外分光光度計購自美國Thermo公司，實時熒光定量儀購自美國BioRad公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，miRNA反轉錄試劑盒購自德國QIAGEN公司，實時熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司，其他化學試劑均購自北京科昊生物工程有限公司。miR-21-5p引物：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；miR-29-3p引物：5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3′；miR-139-5p引物：5′-UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU-3′；下游通用引物和內參U6引物均由試劑盒提供。操作步驟：①RNA提取：取液氮中卵巢組織，用研磨器研碎；加入適量TRIzol，室溫靜置10 min。加入適量氯仿并混勻，低溫12 000 r/min離心10 min，吸取上層透明液體；加入適量異丙醇，混勻并低溫12 000 r/min離心10 min；乙醇洗滌，低溫12 000 r/min離心5 min；室溫干燥，加入無RNA酶水溶解，紫外分光光度計定量并-80 ℃保存。②miRNA cDNA反轉錄及熒光實時定量：取RNA并嚴格按照QIAGEN公司miRNA反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，配制20 μL反應體系。反應條件：37 ℃反轉錄60 min，95 ℃滅活5 min。取反轉錄產物配制20 μL反應體系，置于熒光定量儀中進行反應。反應條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40個循環。miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對表達量以2-Δct計算。以正常卵巢組織miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對量平均值為界定標準，高于平均值為高表達，低于平均值為低表達。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對表達量比較 與正常卵巢組織、BEOT組織相比，EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p相對表達量增加， miR-139-5p相對表量降低(P均<0.05)。正常卵巢組織與BEOT組織比較，差異無統計學意義。見表1。

表1 不同卵巢組織中miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對表達量比較

注：與正常卵巢組織比較，*P<0.05；與BEOT組織比較，#P<0.05。

2.2 miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p表達與EOC患者臨床病理特征的關系 不同年齡和病理組織類型EOC組織miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p高表達者比較，差異無統計學意義；與中高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的EOC組織相比，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的EOC組織miR-21-5p和miR-29-3p高表達者多，miR-139-5p高表達者少(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p表達與EOC患者臨床病理特征的關系(例)

3 討論

EOC是惡性程度較高的婦科腫瘤，其發病機制和臨床治療新策略一直是基礎和臨床研究的熱點問題之一[4，5]。miRNAs廣泛參與細胞發育、分化及衰老等幾乎所有生命活動的調節[6]，目前是腫瘤研究的熱點之一[7]。

miR-21-5p已經被證實在乳腺癌、胃癌和肝癌等多種癌組織中高表達，被認為在腫瘤發生發展中扮演著癌基因的角色[8]。miR-21-5p促進腫瘤發展的機制，主要認為與靶向下調重要的腫瘤抑制分子PTEN相關。婁艷輝等[9]研究發現，EOC組織較正常卵巢組織存在miR-21-5p表達上調現象，推測其與患者不良預后密切相關，能否作為EOC的治療靶標和預后指標尚需進一步大樣本研究。本研究結果表明，EOC組織中miR-21-5p相對表達量高于BEOT組織和正常卵巢組織，與相關文獻報道一致；并且，相比于中高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的EOC組織，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的EOC組織miR-21-5p高表達者增加，提示其與EOC的分化程度和轉移密切相關。

miR-29-3p在腫瘤發生發展中的作用爭議較大。Zhu等[10]報道，非小細胞肺癌患者組織和血清中miR-29c表達水平較正常人顯著升高，推測其扮演著重要的促癌角色；然而，褚慶華等[11]在食管鱗狀細胞癌研究中發現，miR-29c可以通過靶向T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1而抑制腫瘤細胞侵襲和轉移。然而，關于miR-29-3p在EOC中的表達和作用卻鮮見報道。本研究結果顯示，EOC組織中miR-29-3p相對表達量高于BEOT組織和正常卵巢組織，并且在低分化、高分期和有淋巴結轉移的EOC組織中高表達者顯著增多。表明miR-29-3p在EOC組織中可能通過某種機制發揮促進腫瘤發生和發展的作用，但具體機制尚需進一步研究。

研究發現，miR-139-5p在各種腫瘤中作用同樣具有較大差別。Li等[12]報道，miR-139-5p在結腸癌、頭頸部腫瘤和結腸組織癌中較相應正常組織表達下調，具有一定抑制腫瘤發生發展的重要作用。廖信芳等[13]報道，miR-139-5p在結直腸癌組織中較正常結直腸組織表達下調，并發現其可能通過靶向Notch1蛋白而發揮抑癌作用。然而，Bao等[14]發現miR-139-5p在胃癌組織中表達上調發揮促癌作用。然而，到目前為止，尚未見miR-139-5p在EOC組織中表達狀況的研究。本研究結果發現，EOC組織中miR-139-5p相對表達量均低于BEOT組織和正常卵巢組織，且EOC組織中不同分化程度、臨床分期及有無淋巴結轉移病理特征的miR-139-5p表達水平均存在顯著差異。表明miR-139-5p可能在EOC中發揮抑癌作用，然而相關機制尚需進一步研究。

綜上所述，EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p表達上調并可能發揮促癌作用，miR-139-5p表達下調并可能具有一定抑癌作用，三者均可能作為較為理想的預后指標或者治療靶標應用于臨床，值得進一步研究。

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