內生細菌對香茅草產檸檬醛的影響

柳 倩

閻晉東1,2

徐 婷1,2

李 燕1,2

朱詠華1,2

(1. 湖南大學生物學院，湖南 長沙 410082；2. 植物基因組學與發育調控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082)

內生細菌對香茅草產檸檬醛的影響

柳 倩1,2

閻晉東1,2

徐 婷1,2

李 燕1,2

朱詠華1,2

(1. 湖南大學生物學院，湖南 長沙 410082；2. 植物基因組學與發育調控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082)

內生菌對于植物的健康和新陳代謝具有非常重要的作用，目前內生菌對芳香植物香茅草揮發性有機化合物(VOCs)代謝的影響尚不清楚。試驗分離了不同生長季節的香茅草內生細菌，得到1株具有清新自然香味的優勢內生菌CcLf-2，鑒定為芽孢桿菌屬。通過頂空氣相色譜質譜聯用儀對香茅草VOCs進行檢測，發現不同季節其主要揮發性物質檸檬醛含量的變化與CcLf-2的分離率分布規律一致。進一步將CcLf-2接種到香茅草無菌苗中，發現CcLf-2可以成功定殖到香茅草中，并明顯增強其所產檸檬醛的比例。實時定量PCR(qRT-PCR)分析表明，CcLf-2的存在可誘導香茅草中檸檬醛生物合成途徑相關基因的表達量顯著上升(P<0.05)。說明內生菌可以作為誘導子來提高宿主植物中一些重要的VOCs的產量。

內生細菌；香茅草；代謝調節；檸檬醛含量；基因表達

內生菌是一類與植物緊密聯系的特殊微生物，在其生命周期的某一階段或者整個階段定殖于植物組織或器官內，但不引起植物出現明顯病害癥狀[1]。植物內生菌幾乎存在于所有植物中[2]，對植物的生長發育[3-4]，適應性[5]以及多樣性具有非常重要的作用[6]。由于特殊的生存環境，內生菌在長期的協同進化過程中，具有調節其宿主植物次級代謝產物合成的能力[7-8]。揮發性有機化合物(VOCs)是植物次級代謝產物中的重要成分，具有極重要的生物功能，如抗非生物脅迫或生物脅迫；在實際生產中的應用范圍也很廣，從香料的生產到新藥的來源[9]，因而受到越來越多關注。有報道[10]顯示，芳香植物的內生菌對宿主萜類揮發性有機物的產量和質量具有重要的影響，如內生真菌PGP-HSF會影響薄荷中萜類化合物的化學合成。相對來說，關于內生細菌對宿主次級代謝，特別是VOCs影響的報道還非常少。

香茅草，又被稱為檸檬草，是一種重要的香料植物，主要生長在熱帶地區[11]。其VOCs的主要成分是檸檬醛。天然狀態下，檸檬醛主要以橙花醛和香葉醛兩種幾何異構體的形式存在[12]。檸檬醛具有拮抗細菌[13]、真菌[14]以及抗蟲性能[15]，并被廣泛用于生產香料，合成紫羅蘭酮、VA和VE等[16]。然而，芳香植物所產生的檸檬醛還遠不能滿足高速發展的香料行業的需求，所以，探究影響香茅草產檸檬醛的因素極其重要。目前，已有研究顯示生長季節[17]和植物年齡[18]能影響香茅草精油成分，而內生菌對香茅草VOCs的影響未見諸于報道。

本研究擬對不同生長季節的香茅草內生細菌進行分離，并鑒定了具有產香能力的優勢內生細菌。通過對不同季節內生細菌的分布規律以及香茅草揮發性成分進行分析比較，揭示內生細菌與宿主次級代謝產物合成之間的關系。進一步通過植物組織培養技術獲得香茅草無菌苗，并用優勢內生菌對無菌苗進行處理，通過頂空氣相色譜質譜聯用儀(HS-GC-MS)對用菌處理與未處理的香茅草無菌苗的VOCs進行檢測分析。同時，通過實時定量PCR(qRT-PCR)對香茅草中檸檬醛合成途徑中相關基因的mRNA水平的表達情況進行檢測，以發掘內生菌影響香茅草生產檸檬醛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香茅草[Cymbopogoncitrates(DC.) Stapf]：由福建農林大學提供，種植于湖南省長沙市岳麓區湖南大學(28.10' 47.9994"N, 112.57' 0′′E)；

細菌DNA提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；

Prime Script RT試劑盒：寶生物工程有限公司；

氣相色譜-質譜聯用儀: Thermo-Finnigan Trace GC + Polaris Q型， 美國賽默飛世爾科技公司；

qRT-PCR儀：Mx3000P QPCR System型，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 香茅草內生細菌的分離 清洗干凈的香茅草樣品，室溫晾干后,參照文獻[5]進行表面消毒和內生細菌的分離。待內生細菌析出后統計其分離率[分離率為4種分離培養基：大豆酪蛋白培養基(TSA)、甘露醇大豆培養基(MS)、酵母提取物培養基(TWYE)[19]和水瓊脂培養基(WA)[20]分離到內生菌的平均值]，并將其挑出到NA培養基上[21]進行劃線培養得到純培養物。

1.2.2 細菌菌種鑒定 用細菌DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。以此為模板，以通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 對其16S rRNA進行擴增，測序后的序列在NCBI酸數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 中進行比對分析，用GENEDOC軟件和MEGA 5.1軟件構建系統發育樹。

1.2.3 HS-GC-MS分析 將新鮮的香茅草用SiO2研磨，所得汁液轉移到20 mL色譜瓶。檢測條件參照文獻[22]，所得總離子流圖與NIST08標準質譜數據庫進行對比，對香茅草揮發性成分進行分析鑒定[23]。

內生細菌在NA培養基上培養24 h后，刮取菌體混合于裝有無菌水的20 mL色譜瓶中，用于HS-GC-MS分析，檢測條件同香茅草檢測條件。

1.2.4 香茅草組織培養 新鮮的香茅草樣品剝去1～2層葉鞘，選取幼嫩根狀莖作為外植體進行表面消毒：70%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗，2% NaClO浸泡10～15 min，無菌水沖洗3～10次，于超凈工作臺晾干。將香茅草樣品切成1 cm左右轉移到NB培養基[24][2.0 g/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)]誘導愈傷組織。2周后，將愈傷組織轉移到MS培養基[25][3.0 g/L激動素(KT)，0.05 mg/Lα-萘乙酸(NAA)]進行分化。培養溫度為28 ℃，14 h光照/10 h黑暗，光強為80 μmol/(m2·s)。

2.3 轉染pSIREN-hTERT對A2780細胞增殖的影響 MTT比色法描繪細胞生長曲線提示，空白對照及轉染pSIREN-Con對照質粒的A2780細胞生長速率相近，而pSIREN-hTERT轉染的A2780細胞生長速率明顯降低，后者分別與前兩對照組比較差異有統計學意義(均P<0.05)，表明靶向hTERT的shRNA導入抑制了A2780細胞的增殖能力。見表1。

1.2.5 優勢內生菌處理香茅草無菌苗 將內生細菌的發酵液稀釋至1×105CFU/mL，待組培瓶中生根培養基[1/2 MS[25]，0.05 mg/L NAA]冷卻至35 ℃左右時，加入發酵液2 mL，在培養基中加入2 mL無菌水作為對照。待培養基冷卻至室溫后，將90 d苗齡的香茅草幼苗轉移到培養基上進行培養。

1.2.6 植物總RNA提取和qRT-PCR 使用植物總RNA 快速抽提試劑盒對香茅草總RNA進行提取，使用Prime Script RT試劑盒合成cDNA。qRT-PCR引物參照文獻[26]。qRT-PCR反應體系及擴增程序參照文獻[27]。每個反應重復3次，使用2-ΔΔCt方法計算基因表達相對值[28]。無菌水處理的香茅草基因表達水平設為1。

2 結果與討論

2.1 香茅草產香內生細菌的分離

通過對2015年7月～2016年6月的香茅草內生細菌進行分離，從14 376個香茅草組織樣品中分離出3 594株內生細菌。在所分離的內生細菌中，發現一株細菌不管是在不同的生長季節還是在不同的香茅草組織中，析出頻率都比較高，將其命名為CcLf-2。通過形態學觀察結合16S rRNA序列分析，鑒定該菌為芽孢桿菌屬(Bacillus)(圖1 )。據報道[29]，一些內生真菌可以產生與其宿主植物相似的次級代謝物，如紫杉醇。然而，關于內生細菌的類似研究卻很少見[7]。通過感官評定，發現分離自香茅草的一些內生細菌可以產生清新自然的香味，尤其是CcLf-2，香味很明顯。芽孢桿菌屬的菌種具有抗菌、除臭等多種生理功能[30]，但是其具有產香能力卻是首次發現。通過HS-GC-MS檢測CcLf-2的揮發性物質，表明CcLf-2的揮發性成分中含有桃醛、紫羅蘭酮等重要的香料物質(表1)。

表1 Bacillus sp. CcLf-2的揮發性成分分析Table 1 The volatile organic compounds ofBacillus sp. CcLf-2

分支點上的數字表示構建系統發育樹時1 000次計算時形成該節點的百分比

圖1 CcLf-2的16S rRNA基因系統發育樹

Figure 1 Phylogenetic tree of CcLf-2 16S rRNA gene sequences

值得注意的是，不同季節CcLf-2的分離率(圖2)與香茅草內生細菌的總分離率(圖3)的變化趨勢相反，即具有產香能力的優勢菌CcLf-2析出頻率高的時候，并不對應著內生細菌在宿主植物香茅草中分布最豐富的季節。而香茅草揮發性物質的組成及比例隨季節發生變化，因此懷疑這一變化是否與產香內生細菌的特殊分布存在關聯。為了驗證這一猜測，通過HS-GC-MS對不同季節香茅草VOCs進行檢測。

2.2 不同季節香茅草VOCs分析

利用HS-GC-MS，鑒定出香茅草中9個揮發性成分(表2)。主要包含檸檬醛(以橙花醛和香葉醛兩種幾何異構體的形式存在)和α-蒎烯，這兩種物質均廣泛應用于香料生產中。有研究報道香茅草精油中含有30多種揮發性物質[31]，本研究只分離鑒定到9種，其原因可能有以下兩點：① 不同于傳統提煉精油的方法，本研究直接用石英砂來研磨新鮮的香茅草樣品，可能會導致一些含量很少的成分損失；② 本研究通過頂空自動進樣器來收集樣品，在此過程中，一些高沸點的化合物難以自然擴散到進樣器中。但本方法快速便捷，能滿足獲得主要VOCs的需要。由表2可知，不同季節香茅草VOCs的比例發生了明顯的變化，其中橙花醛和香葉醛的比例在春季和夏季明顯高于秋冬季節，與之前提到的優勢內生細菌CcLf-2在不同季節的分布規律的變化趨勢一致(圖2)。因此，寄生于香茅草內的產香內生細菌可能會對其VOCs，尤其是主要成分檸檬醛的含量有一定的影響。

圖2 不同季節優勢內生細菌Bacillus sp. CcLf-2的分離率Figure 2 The isolation rate of dominant endophytic bacteriaBacillus sp. CcLf-2 in different seasons

圖3 香茅草內生細菌的總分離率Figure 3 General endophytic bacteria from C. citratusin different seasons表2 不同季節香茅草揮發性成分分析Table 2 Volatile organic compounds obtained fromC. citratus in different seasons

物質分子式相對峰面積/%春季夏季秋季冬季α-蒎烯C10H1662.7168.4989.3393.57β-羅勒烯C10H161.360.371.370.66馬鞭草烯醇C10H16O0.800.490.190.272,2-二甲基-3,4-辛二烯C10H16O—0.850.090.15橙花醛C10H16O13.9815.164.703.89香葉醛C10H16O19.8211.163.610.51α-蓽澄茄油烯C15H240.620.820.320.37β-欖香烯C15H240.381.920.150.16石竹烯C15H240.330.730.240.42

2.3 內生菌CcLf-2對香茅草VOCs的影響

為了進一步驗證內生細菌對香茅草VOCs的影響，首先通過植物組織培養技術獲得了香茅草無菌苗(圖4)，以排除其他微生物的干擾。將內生細菌CcLf-2接種到香茅草無菌苗培養基中，CcLf-2可以通過香茅草的根部滲入香茅草。通過重分離試驗，從香茅草組培苗的葉片和鞘中分離出了CcLf-2(圖5)，證明其的確可以成功定殖在香茅草中。通過HS-GC-MS檢測接種了CcLf-2(E +)和未接種CcLf-2(E-)的香茅草無菌苗以及野生香茅草幼苗(W)的VOCs，發現接種CcLf-2后，香茅草VOCs中橙花醛和香葉醛的比例明顯增加(表3)，說明內生細菌CcLf-2可以誘導香茅草主要揮發性物質檸檬醛的產生。值得注意的是，生長同期，大小一致的野生香茅草幼苗，其檸檬醛的含量明顯高于CcLf-2處理后的香茅草組培苗，表明內生菌誘導香茅草VOCs中檸檬醛比例的增加可能不只依賴單個菌種，而是依賴整個微生物菌群。

2.4 CcLf-2對香茅草中萜類化合物生物合成基因表達的調控

為了進一步探討內生細菌誘導宿主香茅草中檸檬醛合成的分子機制，通過qRT-PCR分析香茅草中檸檬醛代謝途徑相關基因的轉錄表達水平。異戊烯二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)是萜類化合物生物合成的兩種前體物質[32]。植物體主要通過甲羥戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑來合成IPP和DMAPP[33-34]。本研究對MVA途徑中的3個基因[甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、甲羥戊酸激酶(MK)、甲羥戊酸二磷酸脫羧酶(MDC)]和MEP途徑中的5個基因[1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶(DXR)、5-二磷酸-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK)、2,4-環磷酸合酶(MCS)、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸合酶(HDS)]進行了檢測。這些基因都是萜類物質合成途徑中的關鍵基因[26]。由圖6可知，與未處理的香茅草無菌苗相比，用CcLf-2處理過的香茅草組培苗中除MCS以外，所有檢測基因的表達量均顯著性上調(P<0.01)，特別是MVA途徑中的基因。植物揮發性萜類化合物的合成涉及到一系列復雜的生化反應過程，是多種基因相互作用的結果。由于香茅草基因組信息有限，雖然只檢測了部分基因的mRNA水平，但已有結果仍表明內生細菌CcLf-2在香茅草中的定殖可以通過調控與萜類物質合成相關的基因的表達水平來提高檸檬醛的合成。

A. 香茅草外植體在NB培養基上培養2周后形成的愈傷組織 B. 香茅草愈傷組織在MS分化培養基上培養7 d形成的芽 C. MS培養基上培養2個月的香茅草無菌苗

圖4 香茅草組織培養

Figure 4 The tissue culture ofC.citratus

圖5 從未接種CcLf-2(E-)和接種CcLf-2(E +)的 香茅草組培苗中重分離CcLf-2

Figure 5 The bacteria CcLf-2 reisolation result from CcLf-2-free (E-) and CcLf-2-inoculated (E+)C.citratusaseptic seedlings

表3 內生細菌CcLf-2處理(E+)和未處理的香茅草組培苗(E-)以及香茅草野生幼苗(W)的揮發性成分分析

Table 3 Volatile organic compounds obtained from endop-hyte CcLf-2-inoculated (E+), CcLf-2-free (E-)C.citratusaseptic seedlings and wildC.citratusseedlings (W)

物質分子式相對峰面積/%E-E+Wα-蒎烯C10H1689.9785.1680.75β-羅勒烯C10H16——2.10馬鞭草烯醇C10H16O1.372.630.06橙花醛C10H16O0.831.963.98香葉醛C10H16O3.406.1011.04α-蓽澄茄油烯C15H242.232.181.49β-欖香烯C15H240.850.740.46石竹烯C15H241.341.230.18

E-：香茅草無菌苗；E +：CcLf-2處理10 d的香茅草組培苗；星號表示與香茅草無菌苗的顯著差異， * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001圖6 香茅草中與MVA和MEP合成途徑相關的基因表達水平分析Figure 6 The expression levels of genes responsible for MVA pathway and MEP pathway (n=3)

3 結論

本研究探究了內生細菌對香茅草VOCs的影響。結果表明，分離出的香茅草優勢內生細菌CcLf-2可以成功定殖在香茅草無菌苗中，通過調控其與萜類化合物合成途徑相關基因的表達水平可提高檸檬醛的合成；初步揭示了內生菌誘導香茅草檸檬醛合成的分子機制，證明內生菌作為提高一些高商業價值天然產物產量的誘導子，具有很大的開發潛力。然而，內生菌誘導宿主香茅草產檸檬醛的詳細分子機制還需要進一步研究；如何通過控制內生菌的接種方法和接種量，使香茅草檸檬醛的產量達到最大，從而應用于實踐生產當中仍需要進一步摸索。

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Effects of endophytic bacteria on citral production inCymbopogoncitratus(DC.) Stapf

LIUQian1,2

YANJin-dong1,2

XUTing1,2

LIYan1,2

ZHUYong-hua1,2

(1.CollegeofBiology,HunanUniversity,Changsha,Hunan410082,China; 2.HunanProvinceKeyLaboratoryofPlantFunctionalGenomicsandDevelopmentalRegulation,Changsha,Hunan410082,China)

The existence of endophytes significantly contributes to plant health and metabolism, however, the effects of endophytes on the volatile organic compounds (VOCs) metabolism of aromatic plantCymbopogoncitratusare still unclear. In this study, the endophytic bacteria fromC.citratusgrown at different seasons were isolated, and a dominant endophytic bacteriumBacillussp. CcLf-2 was identified, with a fragrance-producing property. After seasonal analysis of the VOCs ofC.citratusby headspace gas chromatography-mass spectrometry, found that the abundance pattern of CcLf-2 had a similar trend with the emission profile of citral, the primary and valuable composition of VOCs, inC.citratus. By inoculating CcLf-2 intoC.citratusaseptic seedlings obtained by tissue culture, endophyte reisolation test verified the colonization of CcLf-2 in plants and the presence of CcLf-2, which can increased the citral proportion, obviously. Moreover, quantitative real-time PCR analysis of relevant genes in the citral biosynthesis pathway revealed that they were significantly up-regulated (at least P <0.05) with the existence of CcLf-2. The endophytic bacteria may enhance the citral production by modulating the expression of genes related to biosynthesis. And implies the possibility of using endophytic bacteria as a regulator to improving yields of some important VOCs in its host.

Endophytic bacteria;Cymbopogoncitratus; metabolism regulation; citral production; gene expression

國家自然科學基金(編號：31672093)

柳倩，女，湖南大學在讀碩士研究生。

朱詠華(1968—)，女，湖南大學教授，博士。 E-mail:yonghuaz@outlook.com

2017—04—03

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.002