電化學(xué)法測(cè)量黑曲霉孢子萌發(fā)過(guò)程中葡萄糖氧化酶的活性

劉洋汝

李忠海1,2

任佳麗1, 2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 稻谷及副產(chǎn)品深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

電化學(xué)法測(cè)量黑曲霉孢子萌發(fā)過(guò)程中葡萄糖氧化酶的活性

劉洋汝1

李忠海1,2

任佳麗1, 2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 稻谷及副產(chǎn)品深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

建立了電化學(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定葡萄糖氧化酶活性的方法。該方法引入二茂鐵甲醇作為氧化還原探針，以玻碳電極作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉑絲電極作為輔助電極，采用循環(huán)伏安法，得到不同酶活的峰電流值，在酶濃度為0.128～2.377 U/mL，酶濃度與峰電流之間存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998，檢測(cè)下限為0.128 U/mL。運(yùn)用該法測(cè)定了孢子萌發(fā)過(guò)程中酶活的變化，隨著孢子的萌發(fā)，酶活先增加，達(dá)到最大值(2.130 U/mL)后再次下降，同時(shí)采用傳統(tǒng)滴定法進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果表明，相較于傳統(tǒng)方法，電化學(xué)方法具有準(zhǔn)確、快速和簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。

孢子；萌發(fā)；葡萄糖氧化酶；循環(huán)伏安法

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)是一種需氧脫氫酶，能高度專(zhuān)一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，在食品、畜牧以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。目前工業(yè)中生產(chǎn)葡萄糖氧化酶常采用黑曲酶整菌發(fā)酵法[3]，該方法生產(chǎn)的游離GOD存在穩(wěn)定性差、易變性失活、酶與底物難以分離等缺陷，不利于產(chǎn)物的回收與連續(xù)生產(chǎn)[4-5]。S. Ramachandran等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉孢子是一個(gè)葡萄糖氧化酶的貯存庫(kù)，并通過(guò)檸檬醛透化孢子膜，抑制孢子萌發(fā)，使孢子催化活力增長(zhǎng)到1.500～4.350 g/(L·h)。Moksia等[8]證明黑曲霉孢子具有一個(gè)充滿活力的酶催化體系，孢子本身也可以起到良好的酶固定作用，可作為GOD生物催化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。目前，對(duì)于黑曲霉孢子的研究主要集中在發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸能力[6-10]，然而黑曲霉孢子在哪個(gè)階段的葡萄糖氧化酶酶活力最強(qiáng)，尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)葡萄糖氧化酶酶活力主要采用滴定法和分光光度法，但是這兩種方法測(cè)量精度低，操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。電化學(xué)方法具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，是研究生物化學(xué)和生物活動(dòng)的一種新方法。由于酶在電極表面的取向往往不利于其電活性基團(tuán)與電極之間的電子交換，與電極間的直接電子轉(zhuǎn)移受到阻礙，通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)酶活力歷來(lái)是一個(gè)令人困擾的問(wèn)題。本試驗(yàn)擬以二茂鐵甲醇(Ferrocene methanol，F(xiàn)c)為氧化還原介質(zhì)，介導(dǎo)酶與電極間的電子傳遞，玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，掃描得到循環(huán)伏安曲線，然后將獲得的陽(yáng)極峰電流與酶濃度進(jìn)行線性回歸，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖氧化酶活力的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉 (Aspergillusniger) NRRL3：美國(guó)ATCC公司。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 材料與試劑

葡萄糖：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

吐溫-80：化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

二茂鐵甲醇：216.060 g/mol， 西格瑪奧德里奇公司；

葡萄糖氧化酶：228 253 U/g，西格瑪奧德里奇公司；

檸檬醛：95%，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基，稱(chēng)取 200 g馬鈴薯，加水煮爛，紗布過(guò)濾，加入15 g瓊脂、20 g葡萄糖，補(bǔ)足水分至 1 000 mL，分裝試管，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min；

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：蕎麥種子培養(yǎng)基，稱(chēng)量300 g 市售蕎麥種子，蒸餾水洗兩次，加等量的蒸餾水沸水浴15 min，過(guò)濾，分裝錐形瓶，加塞、包扎，高壓蒸氣滅菌處理，得到50 g水/100 g的蕎麥種子培養(yǎng)基[4]。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

電化學(xué)工作站：660D型，上海辰華儀器有限公司；

雙面凈化工作臺(tái)：SW-CJ-2F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

霉菌培養(yǎng)箱：MJX-150BⅢ型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：TK25KG型，長(zhǎng)沙東旺儀器有限公司；

生物顯微鏡：BM-1000型，致微儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：GI54DWS型，致微儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-98型，天津市泰斯特儀器有限公司；

超純水機(jī)：LS1-10型，湖南中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑曲霉孢子種子液的制備 從冰箱取出凍存黑曲霉孢子液，室溫融化后轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，置于恒溫箱 28 ℃培養(yǎng)7 d。用含有0.1 mL/100 mL 吐溫-80 的滅菌蒸餾水沖洗斜面，收集孢子懸液至離心管，4 ℃ 10 000×g 離心10 min，棄上清液，收集孢子沉淀。稀釋沉淀，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸液濃度108spores/mL。

取1 mL 108spores/mL的孢子懸液于100 g蕎麥種子培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)200 h，然后加入0.1 mL/100 mL 吐溫-80 的滅菌蒸餾水，180 r/min 振搖1 h后，過(guò)濾，收集濾液，4 ℃ 10 000×g 離心10 min，棄掉上清液，收集沉淀，確定109spores/mL 濃度的孢子種子液備用。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1) 電極預(yù)處理：以玻碳電極( GC，Φ= 2 mm) 為工作電極，用 0. 050 μm氧化鋁兌水打磨拋光至鏡面，依次用無(wú)水乙醇、蒸餾水超聲清洗1 min 后，晾干備用。飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極, 鉑絲電極作為輔助電極。

(2) 酶濃度的測(cè)量：往電解池中加入100 μL 4 g/L 葡萄糖溶液，800 μL 1 mmol/L二茂鐵甲醇的0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)，30 ℃水浴5 min，然后依次加入100 μL濃度為0.000，1.282，5.128，10.256，15.384，23.770 U/mL的葡萄糖氧化酶，設(shè)定電壓范圍0.0～0.5 V，掃速0.1 V/s，作循環(huán)伏安掃描。記錄每一個(gè)酶濃度所對(duì)應(yīng)的峰電流值，并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到相應(yīng)的線性回歸方程。

1.3.3 黑曲霉孢子萌發(fā)觀察 接種1 mL 109spores/mL孢子種子液至含25 mL基本培養(yǎng)基[11]的錐形瓶中，在96孔板上每孔定時(shí)加入200 μL 孢子培養(yǎng)液，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。定時(shí)取孢子培養(yǎng)液涂布于載玻片，觀察[12-13]并計(jì)數(shù)100～200個(gè)孢子，以長(zhǎng)出的芽管長(zhǎng)度達(dá)到2倍原孢子長(zhǎng)度為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[14]，計(jì)算孢子萌發(fā)率，之后每隔2 h 觀察，持續(xù)24 h，觀察黑曲霉孢子萌發(fā)狀況。

1.3.4 黑曲霉孢子生長(zhǎng)過(guò)程中的酶活測(cè)定 用移液槍吸取1 mL 109spores/mL 孢子種子液于含25 mL 基本培養(yǎng)基的錐形瓶中，在96孔板上每孔分別在0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h加入200 μL 孢子培養(yǎng)液，30 ℃恒溫培養(yǎng)，每組3個(gè)平行。取對(duì)應(yīng)時(shí)間的黑曲霉孢子培養(yǎng)液100 μL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)試，將得到的峰電流值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程中，計(jì)算得到黑曲霉孢子在休眠、萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)階段的酶活信息。取適量孢子培養(yǎng)液80 ℃滅活30 min，循環(huán)伏安掃描，作為空白組。

1.3.5 對(duì)比試驗(yàn) 選用滴定法：取1 mL梯度稀釋酶液加入到已經(jīng)30 ℃恒溫5 min，25 mL含4 g/L葡萄糖的60 mmol/L (pH=5.6)的乙酸鈉緩沖液中。加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH中停止反應(yīng)。將所得混合物通過(guò)使用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定，酚酞作為指示劑至暗粉色為終點(diǎn)。所加鹽酸的體積為V。空白測(cè)定(孢子溶液不存在)在相同的試驗(yàn)條件下進(jìn)行。添加的標(biāo)準(zhǔn)HCl的體積為V0。葡萄糖酸的濃度可由式(1)計(jì)算，酶活由式(2)計(jì)算，一個(gè)酶活單位為在1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量。

(1)

(2)

式中：

C——葡萄糖酸的濃度，μmol/mL；

E——酶活，μmol/(mL·min)；

N——標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液的摩爾濃度，mol/L；

V0——空白滴定的標(biāo)準(zhǔn)HCl的體積，mL；

V——最終滴定鹽酸的體積，mL；

H——樣品反應(yīng)時(shí)間，min。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶活性電化學(xué)測(cè)定方法的建立

2.1.1 檢測(cè)原理 采用電化學(xué)循環(huán)伏安法檢測(cè)葡萄糖氧化酶的反應(yīng)原理[15-16]見(jiàn)式(3)～(6)，在一定的電壓下，二茂鐵甲醇(Fc) 發(fā)生氧化反應(yīng)失去一個(gè)電子形成Fc+，在有氧化態(tài)葡萄糖氧化酶(GODox)和葡萄糖存在時(shí)，GODox氧化葡萄糖產(chǎn)生還原態(tài)葡萄糖氧化酶(GODred)和葡萄糖酸，生成的GODred還原Fc+產(chǎn)生GODox和Fc，重新生成的Fc補(bǔ)充擴(kuò)散到電極表面發(fā)生氧化，從而增加電子傳遞的速度，峰電流增加。

工作電極表面：

FcCH2OH-e-=FcCH2OH+。

自然教育理念提倡讓幼兒在大自然中自然成長(zhǎng)，幼兒美術(shù)是最接近自然的教學(xué)內(nèi)容，對(duì)提升幼兒成長(zhǎng)品質(zhì)具有重要的促進(jìn)作用。美術(shù)教學(xué)中，教師堅(jiān)持自然教育，讓幼兒在自然氛圍、自然材料、自然互動(dòng)中，充分的感受美、表現(xiàn)美。幼兒對(duì)美術(shù)活動(dòng)始終保持濃厚的興趣，才能全身心投入到美術(shù)創(chuàng)作中，才能獲得更多的歡樂(lè)和笑聲，才能極大實(shí)現(xiàn)課堂教學(xué)目標(biāo)。

(3)

葡萄糖氧化酶：

GOxox+glucose→[GOxox+glucose]，

(4)

[GOxox+glucose]→GOxred+gluconic acid，

(5)

GOxred+ FcCH2OH+→ GOxox+FcCH2OH。

(6)

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 不同濃度GOD的循環(huán)伏安曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著GOD濃度的上升，陽(yáng)極峰電流值在增高。峰電流值與酶濃度呈正比，介質(zhì)濃度增加，電流值上升[17]。以峰電流值對(duì)酶濃度作圖(見(jiàn)圖2)，得到線性回歸方程：y=0.435x+1.414，相關(guān)系數(shù)為0.998。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 連續(xù)10次對(duì)100 μL 10 U/mL的葡萄糖氧化酶樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.031%，表明該檢測(cè)葡萄糖氧化酶活力的方法有較好的精確性。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)備50 μL 1.282 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液，再分別加入50 μL不同活力單位的葡萄糖氧化酶溶液，作回收率試驗(yàn)，對(duì)每份樣品重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果取平均值。由表2可知，回收率在97.208%～104.538%，標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.383%，表明此方法檢測(cè)葡萄糖氧化酶活力具有良好的準(zhǔn)確性。

圖1 不同葡萄糖氧化酶酶濃度下的循環(huán)伏安掃描曲線Figure 1 The CV curves with different GOD enzyme concentration

圖2 峰電流與葡萄糖氧化酶活性的關(guān)系Figure 2 The relationship between the peak current and the GOD enzyme activity

2.2 電化學(xué)方法檢測(cè)黑曲霉孢子萌發(fā)中GOD的活性

2.2.1 黑曲霉孢子的萌發(fā)觀察 定時(shí)取接種于96孔板上中的孢子培養(yǎng)液10 μL涂布于載玻片[18]，采用顯微鏡觀察不同時(shí)間的孢子萌發(fā)情況(以萌發(fā)率表示)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，在0～4 h時(shí)未見(jiàn)孢子萌發(fā)，但孢子體積略有增大；6 h

表1 精密度試驗(yàn)Table 1 Test for precision

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test for recovery

2.2.2 黑曲霉孢子萌發(fā)過(guò)程中的酶活變化 定時(shí)掃描黑曲霉孢子培養(yǎng)液的循環(huán)伏安曲線，將得到的響應(yīng)峰電流值代入到線性回歸方程中，計(jì)算得出其葡萄糖氧化酶濃度。將所得到的酶濃度對(duì)時(shí)間作圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。在孢子萌發(fā)早期，即可以檢測(cè)到葡萄糖氧化酶的存在，Rosenberg等[19]提出了黑曲霉氧化葡萄糖生成葡萄糖酸的能力并不依賴(lài)于完整發(fā)育的細(xì)胞。Moksia等[8]的研究證明在黑曲霉孢子持有一個(gè)活躍的酶系統(tǒng)來(lái)氧化葡萄糖，正如工業(yè)發(fā)酵中常用的黑曲霉菌絲一樣。隨著孢子對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件產(chǎn)生反應(yīng)，孢子吸水膨脹并萌發(fā)，合成新壁物質(zhì)，相較于剛強(qiáng)的孢子膜結(jié)構(gòu)通透性增強(qiáng)，便于自身與外界交換營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，酶體系活躍地氧化葡萄糖合成ATP為生長(zhǎng)供給能量，培養(yǎng)8～10 h時(shí)GOD酶活力達(dá)到高峰。隨后，酶活力下降，可能是隨著菌絲生長(zhǎng)，真菌為了更加復(fù)雜的生命活動(dòng)發(fā)展其他的功能[20]。

表3 孢子隨時(shí)間的萌發(fā)率Table 3 Spores germination rate over time

2.3 對(duì)比試驗(yàn)

在采用電化學(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定孢子萌發(fā)過(guò)程中酶活性的同時(shí)，采用傳統(tǒng)的滴定法進(jìn)行了佐證測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。整體而言，使用滴定法測(cè)出的結(jié)果都略低于電化學(xué)方法，可能是滴定法是通過(guò)肉眼判斷滴定終點(diǎn)的顏色變化。初始孢子的酶活力為 (1.355 ± 0.057) U/mL，隨著孢子開(kāi)始萌發(fā)酶活力增強(qiáng)，趨勢(shì)與使用電化學(xué)方法測(cè)量結(jié)果一致，對(duì)比兩種測(cè)量GOD酶活力的方法，循環(huán)伏安法測(cè)定時(shí)間更短，操作更簡(jiǎn)便，可將該法用于葡萄糖氧化酶的監(jiān)測(cè)。

表4 滴定法測(cè)定葡萄糖氧化酶酶活的結(jié)果Table 4 The results of titration methods for determination of the activity of GOD U/mL

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)研究二茂鐵甲醇、葡萄糖和葡萄糖氧化酶三者之間的循環(huán)伏安特性，建立了電化學(xué)測(cè)定GOD活性的方法，并使用方該法測(cè)定了黑曲霉孢子萌發(fā)過(guò)程中的GOD活性。研究結(jié)果表明：隨著酶濃度的上升，峰電流值呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，且在酶濃度為0.128～2.377 U/mL的范圍內(nèi)線性良好(R2=0.998)。通過(guò)顯微鏡對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)過(guò)程的觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，在30 ℃條件下培養(yǎng)10 h后，孢子的萌發(fā)率可達(dá)到86.534%，此時(shí)的葡萄糖氧化酶活力最強(qiáng)。本研究建立的電化學(xué)測(cè)定GOD活性的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確、快速和客觀地檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)酶以及葡萄糖酶酶活力。將其應(yīng)用到黑曲霉孢子的酶活性檢測(cè)，為開(kāi)發(fā)黑曲霉孢子作為GOD生物催化劑提供了新思路。

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Detection of GOD activity during the germination ofAspergillusnigerspores by electrochemical method

LIUYang-ru1

LIZhong-hai1,2

RENJia-li1, 2

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 2.NationalEngineeringLaboratoryforRiceandBy-productDeepProcessing,Changsha,Hunan410004,China)

In this study, the electrochemical cyclic voltammetry method was developed for the determination of activity of glucose oxidase. The ferrocene methanol was introducing as the redox probes on cyclic voltammetry, using glassy carbon electrode as working electrode, saturated calomel electrode as reference electrode, platinum wire electrode as the counter electrode and the peak current value of different enzyme activity was required . There was a linear relationship between the peak current in enzyme concentration of 1.282～2.377 U/mL with the correlation coefficient as 0.998, the detection limit as 1.282 U/mL. The enzyme activity of spores from dormancy to germination was detected by this new method, as the enzyme activity of spores decreased after increasing first, reaching the maximum (2.130 U/mL). The traditional methods were tested at the same time. Compared with the traditional method, the proposed electrochemical method has the characteristics of accurate, fast and convenient.

Aspergillusnigerspores; germination; glucose oxidase; cyclic voltammetry

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31340059)；湖南省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2017JJ3523)；糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：湘教通[2013]448號(hào))

劉洋汝，女，中南林業(yè)科技大學(xué)在讀碩士研究生。

任佳麗(1977—)，女，中南林業(yè)科技大學(xué)教授，博士。 E-mail:rjl_cl@163.com

2017—03—20

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.017