基于多重熒光PCR檢測的肉及其制品中鴨DNA成分的鑒別方法

林 霖

陳國培

何永盛

楊國武

賴心田

(深圳市計量質量檢測研究院，廣東 深圳 518131)

基于多重熒光PCR檢測的肉及其制品中鴨DNA成分的鑒別方法

林 霖

陳國培

何永盛

楊國武

賴心田

(深圳市計量質量檢測研究院，廣東 深圳 518131)

針對現有肉制品中鴨DNA成分檢測方法不能檢測番鴨DNA成分的問題，通過下載番鴨、家鴨及其相近物種的12S rDNA序列，使用CLUSTAL X2進行序列比對，篩選特異性序列，設計了一對通用引物及兩條番鴨、家鴨特異性探針，構建了可同時檢測番鴨、家鴨DNA成分的實時熒光PCR方法。結果表明：最終構建的檢測方法可在摻偽量為0.1%的情況下，檢測出樣品中的家鴨或番鴨DNA成分。該方法相比普通PCR或單重熒光PCR檢測方法節省了勞動力，提高了檢測效率，補充了現有檢測方法的不足，為更有效地識別摻偽肉類提供技術支持。

番鴨；家鴨；肉制品；實時熒光PCR；DNA

自2013年爆發“馬肉風波”以及“假羊肉事件”以來，肉類食品摻偽問題顯然已成為全球性的食品安全問題[1]。鴨肉由于其廉價且顏色等性質與紅肉接近，因此使用鴨肉摻假更加具有隱蔽性，多被發現用于相對價格較高的羊肉中進行摻偽[2]。肉類摻假不僅涉及經濟利益，若使用未經檢驗檢疫的病死肉摻偽，還可能嚴重威脅消費者的身體健康。

據調查[3-5]，中國飼養的肉鴨品種主要有兩種，一個是起源于鴨科(Anatinae)鴨屬(Anas)中綠頭野鴨(AnasPlatyrhynchos)和斑嘴鴨(A.poecilorhyncha)，即家鴨；另一個是起源于鴨科(Anatinae)棲鴨屬(Cairina)中疣鼻棲鴨(Cairinamoschata)的番鴨。番鴨原產于南美洲和中美洲熱帶地區，17世紀番鴨由東南亞引入中國，已成為中國的主要飼養品種之一。現有文獻[3-5]對番鴨的研究多集中在飼養上。

食品中肉類成分的鑒別技術不斷發展，已逐步形成了基于蛋白質和基于DNA的兩種檢測方法。其中，由于肉類食品中蛋白質的穩定性差、含量變化范圍廣，干擾因素多等原因，均導致了該類方法靈敏度較低、假陽性率較高的現象[6]。雖然可基于熱穩定蛋白[7-8]，免疫小鼠，篩選單克隆抗體，建立ELISA檢測方法，但由于肉類耐熱蛋白物種間序列差異太小，導致特征單克隆抗體的篩選極困難[9]。在食品加工過程中，DNA的耐熱穩定性、耐酸堿穩定性均高于蛋白質。因此目前在肉類食品屬性鑒別方面，基于DNA的檢測方法為主要檢測方法。中國已頒布關于鴨的PCR檢測方法有SN/T 3731.5—2013 《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分：鴨成分檢測PCR法》、SN/T 2727—2010 《飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR方法》。同時，也有一些已發表文獻[2,6,10-11]中公布了鴨DNA成分檢測方法,但是這些方法均不可以檢測番鴨DNA成分，考慮到番鴨已是中國養鴨業中極為重要的品種[4]，而使用現有標準方法檢測容易導致漏檢。本試驗擬通過在國際公認NCBI Gen-bank數據庫下載獲取的核酸序列，通過CLUSTAL序列比對軟件比對獲取特異性序列，并在該序列基礎上設計了一套一次反應即可同時測試家鴨和番鴨DNA的特異性引物探針，并對所構建的檢測方法檢測限、特異性測試，所構建的方法能夠達到有效防止漏檢問題的目的，更好地為食品安全執法提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉及肉制品：市售；

實時熒光PCR反應預混液[Premix ExTaq(2×)]：分子生物學級，寶生物工程(大連)有限公司；

引物、探針：HPLC級，上海生工生物工程有限公司；

核酸提取試劑盒[DNeasy mericon Food Kit(69514)]：分子生物學級，凱杰生物技術(上海)有限公司；

實時熒光PCR儀：7500型，美國ABI life technologies公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit(69514)說明書操作。

1.2.2 引物探針設計 從NCBI Genbank數據庫下載家鴨(EU755253、HM010684、EU755252)、番鴨(EU755254、HM063542)、斑嘴鴨(AY164517)、家鵝(EU932689)、鴻雁(AY164524)、雞(GU261719)、家鴿(NC013978)、鵪鶉(X572245)、北美火雞(EF153719)的線粒體12S rDNA全基因序列，使用CLUSTAL X2進行序列比對。

1.2.3 實時熒光PCR反應體系及程序

(1) 反應體系(20 μL)：正向引物(20 μmol/L)0.4 μL，反向引物(20 μmol/L)0.4 μL，番鴨及家鴨探針mix(各20 μmol/L)0.2 μL，Premix ExTaq(2×)10 μL，滅菌超純水4 μL，DNA模板5 μL。

(2) 反應程序： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 34 s；40個循環。

(3) 結果判斷： Ct值≤35時，可判定檢測結果為陽性；Ct值≥35時，可判定檢測結果為陰性。

1.2.4 特異性試驗 提取各種肉類(家牛、水牛、豬、綿羊、山羊、馬、兔、鼠、雞、家鴨、番鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、火雞)DNA作為擴增模板，使用DNA條形碼檢測方法(BOLD System)對肉類鑒定，以確保樣品的真實性。使用番鴨、家鴨引物探針驗證方法的特異性。

1.2.5 靈敏度試驗 取下瘦肉部分，使用粉碎機粉碎，然后互相摻比混合成0.1%～50.0%的人工摻假肉，使用番鴨、家鴨引物探針檢測其靈敏度。

1.2.6 樣品檢測 對143批次牛羊肉制品及96份牛羊肉切片進行檢測。

2 結果與分析

2.1 引物探針的設計

引物設計時，共分析了家鴨、番鴨、斑嘴鴨、家鵝、鴻雁、雞、家鴿、北美火雞、鵪鶉的線粒體12S rDNA全基因序列。找到了一段127 bp的特征片段，在該序列上，通過設計鴨DNA檢測通用引物，以及分別設計家鴨、番鴨探針，實現了在同一管反應中檢測家鴨、番鴨DNA成分，見圖1。

已有的DNA檢測方法中，肉類鑒別的靶基因主要集中于兩種DNA序列：線粒體DNA序列和染色體DNA序列。其中，線粒體DNA在肉類細胞中拷貝數多，且為環狀DNA，在食品的加工過程中不易被破壞，以此尋找特異性序列開發檢測方法，其靈敏度高，且在深加工食品中也能夠穩定檢測，是肉類食品屬性鑒別的首選[1,10]。本研究選取了線粒體DNA中12S rDNA片段，找到了家鴨、番鴨的特征序列，12S rDNA為目前實時熒光PCR常用的靶基因位點[12-13]，NCBI數據庫中各物種12S rDNA基因序列較為齊全，這有助于提高引物探針設計的特異性。

2.2 特異性試驗結果

2.2.1 DNA條形碼檢測結果 用于特異性實驗驗證的肉類經DNA條形碼技術鑒定，與相關物種序列匹配度達99%，可確認其真實屬性，見表1。

基于DNA的實時熒光PCR法目前在肉類食品檢測中為公認的核心檢測方法，現有檢測標準大多基于該方法[6,14-15]。而另外一種在物種屬性鑒別領域發展迅速的方法為DNA條形碼技術，其使用一段公認的標準DNA片段，對物種進行鑒定，通常采用680 bp左右長的COI序列[16-17]，將測序獲得的序列與生物信息學數據庫比對，獲得匹配信息，得以鑒定物種屬性。但是對于深加工的肉類食品，?；旌嫌卸喾N物種的DNA，而檢測用引物是通用引物，現有測序方法無法完成混合樣品的直接測序，對其進行鑒定需挑選多個PCR產物轉化后單克隆菌落，過程繁瑣且存在極大的漏檢可能性[16]。因此該技術在深加工肉類食品中使用時的便捷性及準確性不及實時熒光PCR法。本研究使用該方法對特異性試驗肉類樣品屬性進行鑒別，以保證方法驗證的準確性。

表1 DNA條形碼檢測結果Table 1 Detective Result Based on DNA Barcoding Technology

2.2.2 特異性檢測結果 提取各種肉類DNA作為擴增模板，包括家牛、水牛、豬、綿羊、山羊、馬、兔、鼠、雞、家鴨、番鴨、鵝等DNA，進行熒光PCR反應，以驗證方法的特異性，見表2。驗證結果表明該方法具有很高的特異性，番鴨和家鴨引物探針可特異擴增鴨DNA成分。

表2 特異性試驗結果Table 2 Results of Specificity Detected by Real-time Fluorescence PCR Assays

2.3 靈敏度試驗結果

使用粉碎機粉碎，然后互相摻比混合成0.1%～50.0%的人工摻假肉，檢測其靈敏度。檢測結果顯示0.1%的番鴨肉和家鴨肉可以被檢出，見表3及圖2。依據SN/T 2051—2008 《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時 PCR 法》和SN/T2727—2010 《飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR方法》 等標準實時熒光PCR檢測方法對動物屬性DNA成分的檢測限為0.1%。通過靈敏度試驗測試，本研究建立的多重PCR方法可達到該檢測限。

圖2 靈敏度試驗結果圖Figure 2 Result of Sensibility Experiment Detected by Real-time Fluorescence PCR Assays表3 鴨引物探針靈敏度試驗結果列表Table 3 Result of Sensibility Experiment Detected by Real-time Fluorescence PCR Assays

所含肉比例Ct值平行1平行2R250%家鴨/50%番鴨16.7/16.816.9/16.740%家鴨/40%番鴨17.2/17.317.1/17.430%家鴨/30%番鴨17.4/17.617.6/17.520%家鴨/20%番鴨18.3/18.618.3/18.80.991/0.97210%家鴨/10%番鴨19.5/19.119.6/19.35%家鴨/5%番鴨20.4/20.120.5/20.40.1%家鴨/0.1%番鴨26.5/26.026.3/26.1

2.4 樣品檢測試驗結果

對143批次牛羊肉制品及96份牛羊肉切片進行檢測，在9批次中檢測出家鴨或番鴨DNA成分，其中檢出家鴨DNA成分，檢測結果與SN/T 2727—2010 《飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR方法》 中鴨DNA成分檢測結果一致，見表4。本試驗證明了使用本研究建立的多重檢測體系可在實際檢測中應用。

表4 樣品檢測結果Table 4 Samples Detected Result

3 結論

本研究根據特征序列，對家鴨、番鴨設計了一對通用引物，減少了PCR體系中引物對的數量，減少擴增體系的負擔，也減少了操作步驟；對家鴨和番鴨分別設計了一條特異性探針，可特異性檢測家鴨和番鴨DNA成分，通過探針預混液形式加入擴增體系中并標記不同的熒光基團，使得同一反應體系可同時檢測家鴨和番鴨DNA成分，節省了勞動力，提高了檢測效率。最終構建的檢測體系可檢測低至0.1%的摻偽量。該方法的建立，補充了標準檢測方法的不足，為更有效地識別摻偽肉類提供了技術支持。但由于熒光PCR方法定量需依賴標準曲線，且不同部位或者不同個體的線粒體數量會有所差異等各方面因素，導致該方法不可用于準確定量具體摻偽的含量，后續通過數字PCR技術可能解決該方面的問題。

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A method for dark DNA components detection in meat and productions by multiplex-real-time fluorescence PCR

LINLin

CHENGuo-pei

HEYong-sheng

YANGGuo-wu

LAIXin-tian

(ShenzhenAcademyofMetrology&Qualityinspection,Shenzhen,Guangdong518131,China)

TheCairinamoschataDNA component can not be detected by the current duck DNA component detection methods. By downloadingCairinamoschata,andAnasplatyrhynchosdomesticaand similar species 12S rDNA sequences and compareing them by using Clustal X2 software to find a specific sequence, a pair of universal primers and two individual specific probes were designed based on the sequence, which construct specific detectCairinamoschataandAnasplatyrhynchosdomesticaDNA components real-time PCR system. This detection system can detect as low as 0.1% adulteration. Results: Using this detection system can detectCairinamoschataandAnasplatyrhynchosdomesticaDNA components from the adulteration samples. This method, compares with normal PCR method or single real-time PCR method, requires lesser labor force, and has higher detection efficiency. This method also complements the deficiency of standard detection methods, and provides technical support for more effective identification of adulterated meat.

Cairinamoschata;Anasplatyrhynchosdomestica; Meat; Real-time Fluorescence PCR; DNA ingredient

廣東省質量技術監督局科技項目(編號：2013CZ05)

林霖(1987—)，女，深圳市計量質量檢測研究院中級工程師，碩士。E-mail:softbluefeather@qq.com

2017—03—21

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.019