蕎麥酵母發酵工藝優化及其發酵前后活性成分變化

徐 斌

王 丹1，2

張 嵐1，2

樸春紅3

宋春梅1，2

(1. 吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林 吉林 132013；2. 吉林省中醫藥管理局二級實驗室，吉林 吉林 132013；3. 吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

蕎麥酵母發酵工藝優化及其發酵前后活性成分變化

徐 斌1，2

王 丹1，2

張 嵐1，2

樸春紅3

宋春梅1，2

(1. 吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林 吉林 132013；2. 吉林省中醫藥管理局二級實驗室，吉林 吉林 132013；3. 吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

研究酵母發酵蕎麥的最佳工藝參數，為開發蕎麥保健發酵食品提供參考依據。以蕎麥為原料，采用安琪酵母發酵，以總黃酮含量作為評價指標，對加水量、發酵溫度、接種量、發酵時間進行單因素試驗和正交試驗，確定最佳發酵工藝。其最佳發酵條件為：加水量75%，發酵溫度32 ℃，接菌量0.5%，發酵時間6 h，總黃酮含量由發酵前的4.895 mg/g升高到5.314 mg/g；槲皮素含量從發酵前的1.468 mg/g下降為1.099 mg/g。

蕎麥；發酵；總黃酮；槲皮素

蕎麥(buckwheat)俗稱甜麥，系蓼科蕎麥屬植物，與其他禾谷類糧食作物相比，蕎麥不僅含有豐富的脂肪、維生素、膳食纖維、礦物元素等營養成分，還含有其他糧食作物所沒有的黃酮類、多酚類化合物等，具有藥食兩用價值[1-2]。其中黃酮類化合物是蕎麥最為重要的生物活性物質之一，賦予蕎麥多種生理功能，例如降血糖、降尿糖、降血脂、防便秘等功效[3]。黃酮類化合物(flavonoids)亦稱生物類黃酮，主要成分有蘆丁、槲皮素、山柰酚等。發酵食品是指利用對人體有益的微生物加工制作而成的一類食品[4]，將食品發酵不但可以提高原產品的經濟價值，還可以有效改善食品的營養價值，增加其穩定性。經過發酵可使蕎麥中的復雜成分在微生物的作用下分解成具有生物活性物質的簡單成分，這樣可以增強機體對蕎麥中營養物質的消化吸收，另外蕎麥發酵類食品的研發也大大促進了蕎麥產業的發展[5]。國內外大多研究集中在蕎麥黃酮類化合物的提取，但對蕎麥發酵制品中黃酮類化合物的研究報道多為營養成分定性分析[6]，張英等[7]發現蕎麥花葉經過發酵后黃酮含量下降，且可能產生了新物質。李靜娟等[8]研究蕎麥面包制作過程對蕎麥黃酮的影響，得出發酵可一定程度地提高蕎麥總黃酮的含量，而焙烤過程顯著地降低蕎麥總黃酮的含量。近幾年食物發酵對植物活性成分的影響引起了人們的關注，關于利用酵母發酵蕎麥，研究黃酮含量的變化鮮見報道。本研究擬利用酵母發酵蕎麥，以總黃酮為指標優化發酵條件，并研究黃酮和槲皮素在發酵過程中的含量變化，旨在為開發以蕎麥為主要原料、以發酵為主要生產工藝的食品以及相關研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥：甜蕎麥，吉林省遼源市；

酵母：安琪酵母股份有限公司；

蘆丁和槲皮素：標準品(HPLC≥98%)，上海原葉生物有限公司；

亞硝酸鈉、乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、丙酮：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發器：EV311型，美國萊伯泰科公司；

酶標儀：SyNERGYH1/H1M型，美國伯騰儀器有限公司；

中草藥粉粉碎機：ZN-500型，長沙岳麓區中南制藥機械廠；

離心機：TGL20M-Ⅱ型，湖南凱達科學儀器有限公司；

電子天平：FA1104N型，上海精密科學儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV-1800型，上海欣茂儀器有限公司；

超聲振蕩提取器：KQ-100DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

霉菌培養箱：MJP-150型，上海精宏實驗設備有限公司；

電熱恒溫干燥箱：202-1AB型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥發酵流程及操作要點

酵母活化

↓

蕎麥→粉碎過篩→干燥→加入酵母液→混勻制團→發酵

(1) 將蕎麥去除雜質，經中藥粉碎機粉碎并過40目篩，于干燥箱中在60 ℃烘干至恒重，備用。

(2) 酵母使用前，應加入一定量30 ℃左右蒸餾水進行活化。之后加入蕎麥粉，混合均勻并揉成均勻的蕎麥面團。

1.3.2 單因素試驗 參照文獻[8]和[9]，分別對加水量、發酵溫度、接菌量、發酵時間4個因素做單因素試驗，3次重復，考察各個因素對酵母發酵蕎麥后其中黃酮含量的影響。

(1) 加水量：接菌量為0.5%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為8 h，將加水量(占蕎麥質量百分比)分別設定為70%，75%，80%，85%，90%進行發酵，測定發酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳加水量。

(2) 發酵溫度：加水量為80%，接菌量為0.5%，發酵時間為8 h，將發酵溫度分別設定為24，26，28，30，32 ℃進行發酵，測定發酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳發酵溫度。

(3) 接菌量：加水量為80%，發酵時間為8 h，發酵溫度為30 ℃，將接菌量分別設定為0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%進行發酵，測定發酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳接菌量。

(4) 發酵時間：接菌量為0.5%，發酵溫度為30 ℃，加水量為80%，將發酵時間分別分別設定為2，4，6，8，10，12 h進行發酵，測定發酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳發酵時間。

1.3.3 正交試驗 在單因素試驗結果基礎上，以加水量﹑發酵溫度﹑接菌量和發酵時間4個條件為考察因素，進行三水平四因素正交試驗，以總黃酮含量為評價指標，確定最佳發酵工藝條件。

1.3.4 總黃酮含量的測定

(1) 蘆丁標準曲線的繪制：稱取蘆丁標準品0.011 7 g，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容，得到234 g/mL蘆丁標準溶液，備用。分別移取蘆丁標準溶液0.00，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，1.00，1.50 mL于試管中，補加95%乙醇至1.5 mL，搖勻，然后加入0.25 mL 4% NaNO2溶液，靜置6 min，再加入0.25 mL 10% Al(NO3)3溶液，靜置6 min，最后加入1.5 mL 4% NaOH溶液，混勻。分別取200 mL于96孔板上，用酶標儀在可見光波長510 nm處測定其吸光度值并記錄。以蘆丁濃度(g/mL)為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y=0.006 5X-0.007，R2=0.999 2。

(2) 樣品中總黃酮提取及含量測定：取0.5 g蕎麥樣品于15 mL離心管中，加入15 mL酸性丙酮溶液(丙酮∶蒸餾水∶乙酸=70∶29.5∶0.5，體積比)，密封，并放置在恒溫震蕩培養箱上，在20 ℃、200 r/min的條件下震蕩4 h(對蕎麥中黃酮成分進行提取)，震蕩結束后，將蕎麥提取液在黑暗條件下靜置12 h(對蕎麥中成分繼續進行提取)，之后在10 000 r/min條件下離心10 min，得到上清液。準確移取0.5 mL待測液按1.3.4(1)標準曲線的繪制方法測定吸光度，根據標準曲線方程計算總黃酮質量。3次重復試驗。按式(1)計算蕎麥總黃酮含量[10-11]。

(1)

式中：

X——蕎麥中總黃酮的含量，mg/g；

A1——樣品管吸光度；

A0——空白管吸光度；

V總——樣品管體積，mL；

V1——吸取供試液體積，mL；

V2——樣品供試液體積，mL；

m——樣品質量，g。

1.3.5 槲皮素含量測定

(1) 槲皮素標準曲線的繪制：精密稱取槲皮素標準品4.92 mg，置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶解，定容至50 mL，所得濃度為 9.84 mg/mL的標準溶液，備用。準確吸取上述槲皮素標準溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于10 mL比色管中，加入60%乙醇溶解，定容至刻度。采用紫外分光光度法在370 nm波長下進行測定，以槲皮素(g/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y=0.034 92X+0.001 4，R2=0.993 2。

(2) 樣品中槲皮素提取及含量測定：稱取蕎麥樣品1 g于錐形瓶中，加80%乙醇25 mL溶解，超聲振蕩提取(50 ℃，30 min，100 W)，并在真空泵中抽濾，加少量體積分數80%乙醇清洗濾渣后過濾，重復2次，合并濾液，得到濾液后倒入旋轉蒸發器，于50 ℃旋轉蒸發濃縮，將濃縮液用60%乙醇定容至100 mL。準確移取待測液0.5 mL于10 mL比色管中，按1.3.5(1)標準曲線測定方法依次加入各種試劑，以試劑空白做參比，按式(2)計算蕎麥槲皮素含量[12]。

(2)

式中：

X——樣品中槲皮素的含量，mg/g；

C——樣品管槲皮素濃度濃度，g/mL；

V總——樣品管體積，mL；

V1——吸取供試液體積，mL；

V2——樣品供試液體積，mL；

m——樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 加水量的選擇 由圖1可知，發酵蕎麥中總黃酮的含量隨著加水量的增加先增加后降低，當加水量小于80%時，蕎麥總黃酮含量隨著加水量的增加而增加；當加水量大于80%時，蕎麥總黃酮含量隨著加水量的增加呈先下降后增加趨勢；當含水量達到90%時，蕎麥總黃酮含量達到最大。這表明隨著加水量的增加，蕎麥在發酵過程中黃酮含量增加，但當加水量達到一定量時，可能影響了酵母繁殖，影響了蕎麥發酵,使黃酮含量降低。在試驗過程中當加水量大于80%時，蕎麥面成團性較差，因此加水量取80%左右為宜。

2.1.2 發酵溫度的選擇 由圖2可知，蕎麥總黃酮的含量隨著發酵溫度的上升先增加后降低，發酵溫度為30 ℃時，總黃酮含量達到最大。溫度過低或過高，都會影響酵母活力，因此發酵溫度取30 ℃左右為宜。

圖1 加水量對總黃酮含量的影響Figure 1 Effect of water addition to content of total flavonoids

圖2 發酵溫度對總黃酮含量的影響Figure 2 Effect offermentation temperature to content of total flavonoids

2.1.3 接菌量的選擇 由圖3可知，蕎麥總黃酮的含量隨著接菌量的增加呈現先下降后上升再下降的趨勢，在該趨勢中，當接菌量為0.6%時，蕎麥總黃酮含量達到最大。當接菌量達到一定比例時，酵母菌利用蕎麥程度較高，使蕎麥中黃酮類物質轉化程度增加，但是當接菌量較高時，酵母菌生長可能會受到抑制，而且對蕎麥的利用也會降低，另外考慮生產成本，確定接菌量取0.6%左右為宜。

圖3 接菌量對總黃酮含量的影響Figure 3 Effect of inoculation quantity to content of total flavonoids

2.1.4 發酵時間的選擇 由圖4可知，蕎麥總黃酮的含量隨著發酵時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，在該趨勢中，當發酵時間為4 h時，蕎麥總黃酮含量達到最大。發酵時間較長時，酵母利用蕎麥可能會產生其他酵母代謝產物，黃酮類物質也可能隨著發酵時間的延長而轉化成其他活性成分。因此發酵時間取4 h左右為宜。

2.2 正交試驗

三水平四因素正交試驗因素水平取值見表1，結果見表2。

圖4 發酵時間對總黃酮含量的影響Figure 4 Effect offermentation time to content of total flavonoids表1 因素水平表Table 1 Factor level of experiment

水平A加水量/%B發酵溫度/℃C接菌量/%D時間/h175280.52280300.64385320.76

表2 正交試驗結果Table 2 Result of orthogonal test

由表2可知，酵母發酵的最佳組合是A1B3C3D3，由于理論計算的最佳組合是A1B3C1D3，需要做驗證性實驗。經過驗證，在該條件下蕎麥總黃酮的含量為3.560 mg/g，確定A1B3C1D3為最優組合。蕎麥發酵的最佳工藝條件為：加水量75%，發酵溫度32 ℃，接菌量0.5%，發酵時間6 h。總黃酮的含量為3.560 mg/g。通過極差R可以看出，各因素對蕎麥總黃酮含量變化的影響作用順序為：接菌量>發酵時間>加水量>發酵溫度。

2.3 發酵前后總黃酮、槲皮素含量的變化

黃酮類化合物是蕎麥中最重要的生物活性物質。由圖5可知，發酵后蕎麥面團中總黃酮含量呈增加趨勢。李蒙蒙等[5]研究不同酵母(果酒酵母、葡萄酒酵母、異常漢遜酵母)發酵對蕎麥營養成分影響，通過測定發酵蕎麥發現3株菌能顯著提高蕎麥中總多酚和總黃酮含量，且顯著降低還原糖含量。本實驗室前期研究[13]表明，蕎麥飼喂高脂膳食大鼠，可使其血清SOD、GSH-PX的活性增強及MDA的含量顯著減少；可使其肝臟中SOD活性顯著增強，MDA的含量顯著減少，表明蕎麥具有調節高脂膳食大鼠抗氧化的能力。李蒙蒙等[5]的研究報道提出酵母能夠顯著提升蕎麥的抗氧化特性，且發酵蕎麥提取物的抗氧化活性與總黃酮成分含量呈相關性。因此，發酵蕎麥相對未發酵蕎麥具有更好的營養保健功能。由圖5還可以看出，發酵后槲皮素含量略有降低。李家華等[14]曾報道普洱茶發酵過程中槲皮素的含量一直呈下降趨勢，并推測可能是在發酵過程中微生物產生的糖苷酶水解生成槲皮素類之外的某些游離態黃酮醇苷元所致。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物[15]，經過酵母發酵后，槲皮素也可能轉化成其他類黃酮類物質。

圖5 蕎麥發酵前后其活性成分變化Figure 5 Change of active ingredients in buckwheat before and after fermentation

3 結論

本試驗研究了酵母發酵蕎麥的最佳工藝參數，并對比發酵前后活性物質變化。結明表明，其最佳發酵條件為：加水量75%，發酵溫度32 ℃，接菌量0.5%，發酵時間6 h；發酵后槲皮素含量略有降低，總黃酮含量升高。蕎麥經過發酵后其中脂肪、淀粉、蛋白質等復雜成分在微生物作用下可產生醇類、核酸類、有機酸類、氨基酸類等具有生物活性物質，有利于人類對蕎麥中營養物質的消化吸收，并改善蕎麥制品的品質。本研究結果對研制蕎麥發酵食品[16]、促進蕎麥的有效利用及促進人體健康具有借鑒意義。

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Optimization on buckwheat fermentation process by Yeast and changes of active ingredient before and after fermentation

XUBin1,2

WANGDan1,2

ZHANGLan1,2

PIAOChun-hong3

SONGChun-mei1,2

(1.DepartmentofPublicandHealth,JilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin132013,China; 2.LeverTwoLaboratoryofAdministrationofTraditionalChineseMedicineofJilinProvince,Jilin,Jilin132013,China;3.InstituteofFoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

To research the best optimum parameters of yeast fermentation, provides reference for the development of buckwheat health fermented food. Buckwheat was selected as raw material, which was fermented by AnQi yeast, and the total content of flavonoids was chosed as the evaluation indexes. Through the single factor test and orthogonal test, including water addition, fermentation temperature, inoculation quantity and fermentation time, the optimal fermentation technology was gotten. The optimal fermentation conditions were: water addition 75%, fermentation temperature 32 ℃, inoculation quantity 0.5%, and fermentation time 6 h. Under the conditions, the total flavonoids content was from 4.895 mg/g to 5.314 mg/g, while, the quercetin content decreased from 1.468 mg/g to 1.099 mg/g.

Buckwheat; fermentation; total flavonoids; quercetin

吉林省科技廳重大科技攻關項目(編號：20160519013JH)；吉林省教育廳“十三五”科學技術研究(編號：吉教科合字[2016]第240號)；吉林省科技廳青年科研基金項目(編號：20150520133JH)；吉林省教育廳科學技術研究項目(編號：吉教科合字[2016]第239號)

徐斌(1972—)，男，吉林醫藥學院副教授，碩士。 E-mail:xb-jl@163.com

2017—04—01

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.039