蔡司LSM 7DUO NLO激光共聚焦顯微鏡的應用和管理

許佳玲, 王曉紅, 羅劍文, 龍 釗, 陳云鳳, 張以順

(中山大學 生命科學學院， 廣州 510275)

蔡司LSM 7DUO NLO激光共聚焦顯微鏡的應用和管理

許佳玲, 王曉紅, 羅劍文, 龍 釗, 陳云鳳, 張以順

(中山大學 生命科學學院， 廣州 510275)

介紹了蔡司LSM7DUO NLO激光掃描共聚焦顯微鏡三個組成部分單光子、雙光子和快速掃描的硬件配置和軟件功能以及成像和圖像分析的應用，例如單、雙光子圖像疊加，多視野拼接拍攝、三維重構等功能在生命科學研究中的應用。介紹管理該儀器的一些方法和心得，保障儀器為教學和科研工作提供更好的服務。

激光共聚焦顯微鏡； 雙光子； 圖象采集

0 引 言

激光共聚焦顯微鏡是一種圖像采集和分析的大型儀器，傳統的單光子激光共聚焦顯微鏡是利用連續光激光器作為光源對熒光樣品進行激發后經過一系列光電成像部件進行信息采集和信號放大，由于光路中的共軛聚焦裝置使得焦平面以外的雜散光無法進入探測器從而得到較高分辨率的圖像[1-3]。雙光子激光共聚焦成像是利用飛秒激光器發射的脈沖光對熒光樣品進行激發，只有分布在樣品焦平面的熒光素分子能獲得足夠的光量子發射出熒光，這就避免了非焦平面熒光的干擾，從而提高成像的亮度和信噪比[4-7]。快速掃描的部分是利用線掃描的成像模式提高成像速度，可應用于鈣火花或者微生物運動這類快速反應的拍攝，利于捕捉更多的動態細節。

整臺儀器具備點掃描和線掃描兩種掃描模式，配備由紫外到紅外不同波長的激光器以及高靈敏度探測器；另外配備活細胞工作站可用于長時間對細胞的監測，壓電陶瓷Z軸納米級載物臺等硬件為實驗解決方案提供了更多的選擇。由于該儀器實行校內外共享服務，是生物學實驗教學中心公用儀器平臺中使用頻率最高的儀器之一，在管理和維護方面需要達到更高的標準[8-9]。

1 配置參數

(1) 光源。整機配有8根獨立的激光器，激發光源覆蓋范圍較廣，能夠滿足多種熒光樣品成像需求。單光子激光器波長分別是405 nm、458 nm、 488 nm 、514 nm、561 nm、633 nm；雙光子使用的飛秒激光器波長為 690～1 060 nm；快速掃描部分配備的高功率激光器波長為405 nm、488 nm和532 nm。

激光器發出的激光通過AOTF聲光控制器動態調節激光輸出的強度，調節范圍為0.1%～100%，從而實現掃描范圍內的激光強度控制。

(2) 檢測器。點掃描成像檢測器由2個PMT通道和32個高靈敏GaAsP通道組成，成像最大分辨率可達6 144×6 144，掃描速度最高為8幅/s，可探測單光子和雙光子信號。外置的2個NDD探測器專用于探測雙光子熒光信號，其光路直接由側向收集避免熒光傳輸在多個棱鏡和光學器件中過多損耗，成像最大分辨率6 144×6 144，掃描速度最高為8幅/s。快速掃描部分的線掃描檢測器由2個CDD組成，成像最大分辨率為1 536×1 536，掃描速度最高可達到120幅/s。

(3) 顯微鏡。研究級電動倒置顯微鏡Observe Z1，物鏡10×(NA 0.45)、20×(NA 0.8)；水鏡32×(NA 0.85)、63×(NA 0.85)；油鏡40×(NA 1.3)，100×(NA 1.4)。配置高數值孔徑的物鏡可為成像帶來更高的分辨精度。

(4) 壓電陶瓷Z軸納米級載物臺和活細胞工作站。壓電陶瓷Z軸納米級載物臺Z-Piezo stage最大掃描范圍250 μm，resolution 5 nm，配合LIVE快速掃描探測器可實現更精準和細致的成像效果。活細胞工作站incubator PM S1帶有培養皿和6孔恒溫樣品槽，溫度控制范圍為室溫-60 ℃，精度可達0.1 ℃；加濕加熱模塊、二氧化碳濃度控制在0%～8%和氧氣濃度控制在0%～21%，保證細胞生長的環境，適合長時間觀察。

(5) 軟件。ZEN2011，包含基礎模塊、生理學模塊、拼圖和多點取圖模塊、FRAP模塊可滿足多種實驗圖像攝取和分析。

2 主要功能特點及在生命科學研究中的應用

2.1 單光子、雙光子高精度多通道成像及圖像分析

單光子共聚焦顯微原理是利用短波長高能量的激發光激發樣品發射出長波長較低能量的熒光實現成像，樣品所發出的熒光經過針孔過濾焦平面以外的雜散光使熒光成像更精確，其平面分辨率可達200 nm，成像質量可達到6 144×6 144；而雙光子激光共聚焦成像則是利用長波長的紅外脈沖光進行激發，熒光樣品僅在焦平面能夠得到足夠的光子才能受激發射出較短波長的熒光，所以雙光子激光共聚焦無需針孔就能夠實現焦平面成像，其平面分辨率可達180 nm，圖像的Z軸分辨率較高，其成像質量可達到6 144×6 144。單光子和雙光子熒光圖像以及DIC多通道疊加效果如圖1所示。得到2維圖像可以做熒光半定量、共定位分析，在zen2011軟件中可以在histo和coloc中進行相應操作，分別如圖2、3所示。

2.2 三維重構

樣品在激光共聚焦顯微鏡下可進行連續的光學切片，在軟件中設置光切的起始點和結束點以確定掃描范圍并設置好光學切片之間的間隔，需要注意的是如果進行多個熒光通道的層切，在軟件中選擇“matchpinhole”進行多通道拍攝厚度的校準，較厚的樣品可對不同深度的激發光和PMT電壓可以進行優化；針對小鼠胚胎和器官等超大樣品的三維重構，建議先對樣品進行透明化處理[10-11]，再用雙光子部分進行光切成像。某些熒光容易淬滅的樣品又需要做三維重構時，我們建議使用Piezo載物臺并選擇快速掃描模式進行成像，盡量減少激光在樣品上停留的時間，最大程度降低光漂白效應；得到的連續多張光學切片圖像之后可在軟件中進行3維重構。重構效果可根據樣品的需求和特性在軟件的3D高級應用模塊中進行相應的選擇及調整，最后輸出圖片或視頻，如圖4所示。

圖2 Histo功能及分析結果示意圖

圖3 Coloc功能及分析結果示意圖

圖4 3維重構示意圖

對于一些需要三維重構之后進行分析的特殊樣品，拍攝之后可在Orth功能下進行三維定位分析判斷不同熒光樣品在空間分布的相互關系，如圖5所示。

2.3 圖像拼接

利用zen2011軟件中tile scan模塊可對腦片、動物胚胎、斑馬魚、植物組織等生物樣品的顯微圖像拼接進而完成整體成像(見圖6)。除了在平面上進行拼圖，還可以結合z-stack進行大樣品整體三維重構。拍攝圖像時需要在軟件中設置小圖之間overlap，保證圖像拼接柔和過渡，避免拼接痕跡過于明顯。

圖5 Orth功能下圖像的3D分析圖圖6 拼接拍攝植物根部橫切圖

2.4 長時間活細胞培養觀察

使用zen2011軟件中time series可實現時間序列的拍攝，在菜單中進行時間序列的設置除了設置拍攝數量和時間間隔之外還有多重選擇，比如拍攝的起始、停頓等以及加藥可以設置marker并接通灌流裝置進行觸發等等，使實驗的操作更具人性化。

結合活細胞工作站實現較長時間觀察細胞的形態、記錄細胞內的熒光變化(如鈣離子、PH值的監測)，為了避免細胞多次掃描出現光漂白的情況，建議設置拍攝條件中使用較低激光強度和較高的PMT電壓進行成像。針對特殊樣品，比如一些反應極為迅速或抗淬滅能力較弱的樣品進行相關的圖像采集，建議使用快速掃描模塊進行拍攝。

2.5 激發光譜掃描和發射光譜掃描

激發光譜和發射光譜掃描能夠全面地檢測樣品的熒光特性，為熒光采集和后期圖像處理提供依據。雙光子激光共聚焦是基于非線性光學一種成像模式，熒光素在與生物樣品結合之后可能會出現不同程度的藍移或紅移，可以利用飛秒激光器的連續可調的特點，利用excitation fingerprinting功能模塊進行激發光譜的全面掃描，幫助找尋到最高效成像的激發波長，這種方法同樣適用于對未知樣品的檢測。

發射光光譜掃描則是對樣品在特定波長激光的激發下所發射的熒光分布情況，這類功能適用于解決激發光串擾的熒光樣品，比如解決植物的葉綠體自發熒光、動物切片中的血細胞自發熒光對圖像的干擾[12]。激光共聚焦顯微鏡配備的高靈敏探測器在lambda mode下能夠實現波長8.9 nm每幅圖像一次成像，提高發射光譜掃描的準確性。掃描得到多張不同波長接收到的圖片后在軟件Unmixing功能下可以得到樣品不同部位的發射光光譜曲線，如圖7所示。

圖7 雙光子激發光下樣品不同部位的發射光光譜圖

2.6 光漂白恢復、熒光能量共振轉移

光漂白恢復的實驗用于量化分子流動性，可用于測定細胞膜蛋白的流動性、細胞之間的縫隙連接通信功能[13]。在軟件中需要設置漂白的區域、用于漂白的激光強度、光漂白的次數、拍攝時間序列圖片完整呈現光漂白和恢復的過程等。雙光子激光器的能量較高，針對需要對某些熒光分子較穩定難以漂白的樣品進行光漂白實驗時可以選用；若熒光分子的流動性極好，漂白后恢復的時間非常短，可以用快速掃描模塊進行快速圖像采集盡可能捕捉更多的動態細節。軟件中有相應的數據分析功能，針對集中較常見的情況也給出了擬合的曲線可供選取。

熒光能量共振轉移用于測量分子之間的相互作用，常用的方法有受體漂白法和受體發射測定法；另外雙熒光互補載體系統(BIFC)則更多地被應用于植物細胞的研究中[14-16]。zen2011軟件中配有專門處理熒光能量共振轉移這一類實驗的FRET模塊，便于用戶對采集到的圖像進行分析。

3 維護要點

(1) 規范操作。日常操作嚴格按照操作規程，遵守儀器的開關機流程，做好物鏡的清潔，使用結束后保證激光器充分散熱才能關閉儀器。設置緩沖間將實驗操作區域和成像區域嚴格分開，避免有毒有害藥物試劑污染顯微鏡房。

(2) 儀器室內潔凈度。顯微鏡這類光學儀器，對室內潔凈度要求較高，定期對實驗室內進行除塵和凈化，保持室內空氣潔凈；并要求進入顯微鏡房的人員必須穿實驗服，更換專用的鞋套或拖鞋。

(3) 溫濕度控制。顯微鏡房內為了進行溫度控制，安裝了2臺高功率的冷暖空調，保證室內溫度常年維持在18～22 ℃；南方的天氣比較潮濕，特別是每年的梅雨季節，為了保護光學鏡頭避免霉變，安裝了3臺大容量抽濕機輪流工作，將濕度控制在40%～60%之間。

(4) 遮光。熒光樣品必須避光保護，而雙光子激光共聚焦專用的NDD探測器極容易受外界光線干擾，所以在儀器的避光方面，準備了針對單光子和雙光子成像兩套避光方案，雙光子成像方案利用環保遮光布在顯微鏡不同工作區域進行避光處理，其避光率達到98%以上，圖像采集時盡量減少外界光線干擾。

4 管理模式探討

(1) 通過公用儀器平臺的網站進行網絡預約。用戶必須經過管理員培訓合格之后方能獲得預約權限；提前2～7天進行網上預約，用戶嚴格按照預約時間進行實驗，爽約或遲到會有相應處罰，避免用戶超時預約，造成機時浪費。

(2) 培訓方式。用戶首次使用儀器時，由管理人員陪同拍攝圖像直至用戶能夠自行操作，管理人員也提供相應的前期樣品處理和后期數據分析指導并在網絡上提供了相關操作指南和軟件操作視頻。用戶按照操作規程正規使用儀器和軟件，能夠避免人為錯誤操作造成儀器和人身損害，例如使用結束之后必須讓激光器徹底散熱之后才能關機，保證激光器的正常使用壽命；使用雙光子成像時，更換樣品必須切換到肉眼觀察模式，避免灼傷。

根據使用情況，每學期開展顯微成像技術相關講座，對用戶遇到的各種問題進行分析和探討，增進管理人員和用戶之間的交流。

(3) 后期數據分析。提供zen2011離線軟件可自行安裝使用，針對一些較大圖像，提供臺式工作站級別電腦供給用戶進行高級數據分析，安裝Imaris 3D圖像分析軟件可進一步描繪和計算。

(4) 為校內外提供測試服務。本儀器已被納入廣州地區大型科學儀器協作網為校外單位提供測試服務，每年對外提供服務的機時約為50～100 h。

(5) 定期整理儀器使用情況。定期整理用戶使用的情況，包括用戶所拍攝的樣品和激光器的使用等情況，制定相應的儀器保養計劃，并對激光器的壽命進行預估，及時做好激光器的更新申報。及時收集用戶使用的反饋情況，包括使用出現的疑問和應用發面的需求以及文章發表情況。

5 結 語

激光共聚焦顯微鏡廣泛應用于生命科學、材料學、醫學研究等領域，LSM7DUO NLO 由點掃描共聚焦780LSM與雙光子共聚焦NLO和線掃描共聚焦live三部分組成，搭載這3種不同類型檢測器為用戶提供更多的圖像采集方式；激發光范圍覆蓋紫外到紅外之間，能為更多的熒光樣品提供匹配的激發光；圖像拼接和三維層切等多種拍圖模式性能互補使其在相關研究應用中更加靈活。如此龐大的顯微成像儀器，如何做好維護和管理并且更好地開發利用是儀器管理人員需要繼續研究和深入的問題。

[1] 劉愛平，郭 振，王琦琛.細胞生物學熒光技術原理和應用[M].合肥：中國科學技術大學出版社，2012.

[2] 袁 蘭.激光掃描共聚焦顯微鏡技術教程[M].北京：北京大學醫學出版社，2004.

[3] 王春梅.激光掃描共聚焦顯微鏡技術[M].西安：第四軍醫大學出版社，2004.

[4] P. Michael Conn.共聚焦顯微技術[M].北京：科學出版社，2012.

[5] Alberto Diaspro. Confocal and Two-photon Microscopy: Foundations, Applications ,and Advances [M].New York: Wiley-Liss，Inc，2002.

[6] Denk W，Strickler J H，Webb W W . Two-photon laser scanning Microscopy [J].Science，1990，248：73-76.

[7] 張祥翔.現代顯微成像技術綜述[J].光學儀器，2015，37(6)：550-560.

[8] 張以順，馮 雙，羅劍文，等.實驗教學示范中心大型設備共享平臺建設探索與實踐[J].中國現代教育裝備，2010(21)：15-18.

[9] 馮 雙，張以順，吳卓華.提升高校貴重儀器管理與服務水平途徑的探討[J].實驗技術與管理，2011，28(11)：239-247.

[10] Hiroshi Hama，Hiroshi Kurokawa，Hiroyuki Kawano. Scale: A chamical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain[J].Nature neuroscience，2011，14(11)：1481-8.

[11] Costantini I, Ghobril J P, Giovanna A P D，etal. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging[J]. Scientific Reports，2015(5)： 9808.

[12] 段 妍，關苑君，藍秀健，等.Zeiss LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡的使用和管理[J].實驗室研究與探索，2012，31(8)：228-230.

[13] 趙莉敏，杜蘭平，高宇翔，等.人臍動脈內皮細胞和平滑肌細胞體外培養鑒定及縫隙連接通訊功能測定[J].心肺血管病雜志，2013，23(4)：503-506.

[14] Fan J Y. Splitm Cherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2008，367：47-53.

[15] Helms Volkhard. Fluorescence resonance energy transfer. Principles of computational cell biology[M]. Wiley-VCH，2008:202.

[16] Morell M. Monitoring the interference of protein-protein interactions in vivo by bimolecular fluorescence complementation: the DnaK case[J]. Proteomics，2008(8)：3433-3442.

Application and Administration of Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss LSM 7DUO NLO

XUJialing，WANGXiaohong，LUOJianwen，LONGZhao，CHENYunfeng，ZHANGYishun

(School of Life Science， Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510275， China)

This paper introduces the components and biological applications of the confocal laser scanning microscopy Zeiss LSM 7DUO NLO. Because of three difference kinds of scanning pattern, we have the flexibility of choice in using the microcopy. For example, they are multichannel fluorescence image acquisition overlays with one photon and two-photon images, Multiple view mosaic scanning with huge sample,3D reconstruction, and so on. This paper also introduces the administration and maintenance of the confocal laser scanning microscopy Zeiss LSM 7DUO NLO.

laser scanning microscopy; two-photon; image acquisition

2016-10-15

廣東省自然科學基金項目(2014A030313376)；廣州市科技計劃項目(201510010270)；中山大學實驗教學研究(改革)項目(201650，201658)

許佳玲(1986-)，女，廣東潮州人，碩士，助理實驗師，主要從事激光掃描共聚焦顯微鏡等大型光學儀器的應用和管理。

Tel.：020-84113685； E-mail：jasxu@foxmail.com

張以順(1966-)，男，貴州畢節人，博士，正高級工程師，實驗教學中心副主任，主要從事本科教學實驗建設與管理、大型設備共享平臺建設與管理工作。

Tel.：020-84110797； E-mail：lsszys@sysu.edu.cn

Q 334

A

1006-7167(2017)06-0281-05