定量PCR檢測對侵襲性真菌感染肺組織標本病原真菌的診斷價值*

李 翊

(天津市第一醫院內二科, 天津 300232)

定量PCR檢測對侵襲性真菌感染肺組織標本病原真菌的診斷價值*

李 翊

(天津市第一醫院內二科, 天津 300232)

目的：探討應用定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測技術診斷侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)肺組織標本病原真菌的臨床意義。 方法：收集2010年6月至2016年6月手術切除且病理診斷為真菌感染的肺組織標本33例為研究對象，設計針對真菌的通用引物和針對隱球菌屬和曲霉菌的特異性引物，采用PCR技術和雙脫氧鏈終止法(Sanger法測序)檢測石蠟包埋肺切除組織中的真菌。 結果：33份真菌感染的肺組織標本PCR檢測結果均為陽性，與病理診斷相符，Sanger測序可以鑒定真菌到種別。PCR檢測與Sanger測序敏感性差異無統計學意義(100%比91.67%，P>0.05)，PCR檢測與Sanger測序特異性差異無統計學意義(100%比100%，P>0.05)；PCR檢測種屬鑒定率顯著優于鏡檢(100%比81.82%，χ2=6.60，P=0.01)，PCR檢測與Sanger測序差異不具有統計學意義(100%比90.91%，χ2=3.14，P=0.08)。結論：定量PCR檢測用于診斷侵襲性真菌感染肺組織標本敏感性高、特異性好，具有一定參考意義。

聚合酶鏈式反應； 侵襲性真菌感染； 肺組織； 雙脫氧鏈終止法

侵襲性真菌感染是指真菌侵入人體血液和組織后，經生長繁殖對機體組織、器官功能造成損害并引發炎癥反應的病理過程[1]。隨著免疫抑制劑的廣泛應用、大劑量廣譜抗生素的長期應用和環境因素的危害，侵襲性真菌感染的患病率和死亡率呈現出明顯的上升態勢[2]。患者多因無特征性臨床表現，而易被細菌感染、原發病因遮蓋，錯過治療的最佳時機[3]。因此，快速準確的檢出該類病原菌是治療的關鍵。目前臨床上主要采用人工鏡檢、病理檢查等方法對真菌感染進行檢測，但這些方法敏感性較低、檢測時間長且易受主觀因素影響[4]。定量PCR技術具有簡便快速、靈敏性和特異性高的優點，能夠在極短時間內檢測處組織中微量的真菌DNA，可以在一定程度上彌補傳統方法的不足[5]。在此次研究中，我們對比分析了用PCR和Sanger法測序兩種方法來檢測真菌，以期為臨床診斷提供參考。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2010年6月至2016年6月間我院行肺大泡和肺癌手術切除且病理診斷為真菌感染的肺組織標本33例為研究對象，其中真菌感染組9例，隱球菌感染組10例，曲霉菌感染組14例。兩組病理標本均經我院病理科確診。曲霉菌感染診斷標準：菌絲多呈桿狀且長短不一，直徑為3～5μm，多條菌絲沿相同方向呈45度角反復分支，呈珊瑚狀或放射狀排列。經HE染色后，菌絲與孢子呈灰藍色，背景略呈紅色，嗜銀染色和糖元染色分別呈黑色和紅色。隱球菌感染診斷：染色后菌體為圓形，外周夾膜肥厚呈透明狀，內有反光孢子，無菌絲。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取：將3片6μm石蠟組織切片裝入0.5mlDEXPEA溶液EP管中，蓋上管蓋后于100℃水浴鍋中加熱2min，冷至室溫后加入3U/100μl破壁酶，于37℃環境中靜置45min。于100℃加熱5min,將EP管搖晃3次混勻，繼續加熱5min，4℃下離心10min，冰浴靜置5min。用移液槍吸取吸附樹脂膠狀物上的水層，置入EP管中，加入0.1倍體積的3M醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇后搖勻。于-20℃下靜置30min～1h，4℃下離心10min。去除上清液，加入70%乙醇1ml,4℃下離心10min,去除上清液，將沉淀干燥后用20～25μl的TE緩沖液溶解。

1.2.2 引物設計:見表1。

在美國國家生物技術信息中心的GenBankDNA序列數據庫中查找隱球菌屬、曲霉菌和真菌通用的基因序列，通過pubmed檢索真菌種屬特異性引物或采用Blast軟件進行設計，引物委托南京金斯瑞公司合成。

表1 PCR和Sanger測序引物表

1.2.3 PCR反應體系：采用普通PCR擴增儀進行實驗，反應體系為DNA模板5μL，濃度為20nmoL/μL的引物1μL，Taq酶25μL，補充重蒸水至50μL。于94℃下預變性4Min,再變性45s，于57℃下退火45s，72℃下延伸45s，擴增30個循環。

1.2.4 Sanger測序：Sanger測序委托南京金斯瑞公司完成。

1.3 觀察指標：記錄PCR檢測及Sanger測序對4組肺組織標本的鑒定結果，考察其敏感性、特異度及種屬鑒定率。

1.4 統計學分析：采用SPSS17.0對數據進行處理，計數資料以率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗；P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 組織標本的檢測結果比較：33份真菌感染肺組織標本經真菌通用引物擴增，PCR檢測結果均為陽性，隱球菌感染組、曲霉菌感染組經曲霉菌屬引物、隱球菌屬引物擴增，PCR檢測結果與病理診斷相符。具體結果見表2。

表2 肺組織標本的PCR檢測、Sanger檢測結果比較

表3 PCR檢測與Sanger測序敏感性與特異性比較

2.2 PCR檢測與Sanger測序敏感性及特異性比較：33例患者均經病理診斷確診，真菌感染組不能具體到種屬，因而不能與PRC方法進行敏感性和特異性比較。PCR檢測結果顯示，敏感性為100%，特異性為100%，Sanger測序結果顯示，敏感性為91.67%，特異性為100%。PCR檢測與Sanger檢測敏感性與特異性比較差異無統計學意義(P>0.05)，具體結果見表3。

表4 PCR檢測及Sanger測序鑒定真菌種屬比較n(%)

2.3 真菌種屬鑒定統計：隱球菌感染組中的10份肺組織標本病理診斷為真菌感染，鏡檢不能鑒定其真菌種屬，PCR檢測可以鑒定真菌種屬；除有三份標本Sanger測序不明外，其余30份肺組織標本均可鑒定真菌種屬。PCR檢測種屬鑒定率顯著優于鏡檢(100%比81.82%，χ2=6.60，P=0.01)，PCR檢測與Sanger測序差異不具有統計學意義(100%比90.91%，χ2=3.14，P=0.08)，具體結果見表4。

3 討 論

侵襲性真菌感染又稱系統性真菌感染或深部真菌感染，是一種病死率高的機會性感染疾病，最常發于呼吸系統[6]。近年來，侵襲性真菌感染的發病率顯著上升，相應病原菌譜也在不斷變化，且耐藥率顯著增加[7]。侵襲性真菌感染缺乏典型臨床癥狀，影像學表現特異性低，實驗室檢查陽性率低，這導致其診斷難度大，漏診、誤診率高[8]。

目前針對侵襲性真菌感染的診斷方法主要包括影像學檢查、病理組織學檢查、特異性抗原測定和無菌部位組織鏡檢等[9]。影像學檢查包括MRI、X線片等，對于肺部侵襲性真菌感染診斷具有一定價值，但是影像學特征不具有特異性，也可見于其他病原菌感染。病理組織學檢查是有創檢查，包括病理組織染色、活組織檢查和真菌形態學等部分，其診斷正確率與患者免疫功能、病灶性質、技師水平、標本處理方法緊密相關，且費用高、操作復雜、陽性率低。

PCR是一種新興的分子生物學技術，可對特定DNA片段進行擴增，可用于檢測細菌、真菌、病毒等病原體。PCR用于檢測全血、血清標本具有較高敏感性和特異性，近年來陸續有PCR用于檢測肺組織標本的報道。Sanger法主要用于分析DNA序列，通過測定病原體和腫瘤基因的突變序列能夠鑒定真菌種類、發現突變位點。其中真菌感染組9例，隱球菌感染組10，曲霉菌感染組14例。結果顯示，所有組織標本PCR檢測均為陽性，與病理診斷結果相符。真菌感染組中9份標本，PCR檢測證實為曲霉菌6份，隱球菌3份， Sanger測序結果顯示，實驗A組中曲霉菌感染組織標本可以分為煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉感染，實驗B組中隱球菌感染組織標本可以分為格魯比隱球菌、格特隱球菌感染，真菌感染組中真菌感染組織標本可以分為煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、格魯比隱球菌感染。真菌感染組、隱球菌感染組、曲霉菌感染組各有1例Sanger測序不明。

隱球菌感染組、曲霉菌感染組均經病理明確診斷，真菌感染組不能具體到種屬，因而不能與PRC方法進行敏感性和特異性比較，PCR和Sanger測序檢測結果統計得，PCR方法對應的敏感性和特異性分別為100%，Sanger法對應的敏感性和特異性為91.67%和100%，兩組比較差異不具有統計學意義(P>0.05)。此外，統計三種方法對真菌種屬的鑒定結果發現，PCR方法用于鑒定真菌種屬的能力顯著優于鏡檢(P=0.01)，Sanger測序用于鑒定真菌種屬的能力與鏡檢差異不具有明顯差異。

病理鏡檢雖能根據病原結構特點判斷是否為真菌感染，但由于部分真菌存在結構相似的特點，鏡檢不能有效鑒定真菌種屬。本次研究結果也證實，PCR方法在鑒定真菌種屬方面明顯優于鏡檢。本研究中Sanger測序有3份結果不忙，分析原因可能是標本中的真菌未經培養分離純化，可能同時含有兩種或兩種以上的真菌，另一方面可能是因為實驗過程中存在污染。

[1] Paramythiotou E,Frantzeskaki F,Flevari A,et al.Invasive fungal infections in the ICU:how to approach,how to treat[J].Molecules,2014,19(1):1085～1119.

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[9] 馬清,于農,尹秀云,等.GM、G試驗及真菌培養鑒定對肺部侵襲性真菌感染的診斷價值[J].軍事醫學,2016,40(3):234～236.

1006-6233(2017)06-0999-03

天津市衛生局科研基金項目，(編號：2013JM40132)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.036