防御假單胞菌Pf-5中Rsm調控系統對脂肪酶表達的影響

李猛剛，閆云君

(華中科技大學生命科學與技術學院，湖北 武漢，430074)

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防御假單胞菌Pf-5中Rsm調控系統對脂肪酶表達的影響

李猛剛，閆云君

(華中科技大學生命科學與技術學院，湖北 武漢，430074)

Rsm系統在細菌基因表達調控中發揮著重要作用。以防御假單胞菌Pf-5為研究對象，將其中的rsmY、rsmZ基因敲除，構建rsmY、rsmZ單突變株和rsmY/rsmZ雙突變株，然后分析野生菌和突變株中lipA的全細胞脂肪酶相對活性及染色體整合型lipA-lacZ、lipA′-′lacZ、rsmA′-′lacZ、rsmE′-′lacZ的β-半乳糖苷酶酶活。結果表明，rsmY、rsmZ主要在轉錄后水平影響lipA的表達；rsmY、rsmZ均抑制rsmA和rsmE的表達，在rsmY、rsmZ敲除后，rsmA的表達水平有所提高，而rsmE的表達水平則顯著提高。因此，rsmY、rsmZ對rsmE的影響要明顯高于對rsmA的影響，其主要是通過影響rsmE的表達從而調控Pf-5中lipA的表達。

基因表達調控；脂肪酶；假單胞菌；Rsm；基因敲除；小分子RNA

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一段基因間區域，此區間段的基因無法翻譯或是編碼成蛋白質，基因序列缺乏開放閱讀框，在原核細胞中通常稱為sRNA(small RNA)[1]。研究發現[2-5]，細菌中一些調控因子在調控基因表達的時候需要sRNA(例如RsmX、RsmY、RsmZ)的調節和參與。這些sRNA與蛋白競爭性地和RsmA結合從而調控基因表達。RsmA是假單胞菌屬中高度保守的全局性調控因子，在熒光假單胞菌P.fluorescensCHA0中，它是一個負調控因子，能與RNA分子結合，在轉錄后水平控制著受GacA/GacS系統調節的次生代謝相關基因的表達。RsmA主要通過與調控基因的mRNA結合來抑制調控基因的表達[6]，而這種結合會被rsmX/Y/Z與RsmA的結合所阻止[2,7]。在防御假單胞菌P.protegensPf-5中存在著rsmX、rsmY、rsmZ、rsmA、rsmE等非編碼RNA，它們在細菌基因的表達調控中發揮著重要的作用[8]，一起構成了P.protegensPf-5中的Rsm系統。為進一步了解P.protegensPf-5中調控脂肪酶lipA表達的分子機理，本文通過基因敲除、全細胞脂肪酶相對活性的測定以及qRT-PCR等方法重點研究了Rsm系統與lipA表達的關系。

1 實驗

1.1 材料及試劑

1.1.1 菌株及質粒

防御假單胞菌P.protegensPf-5，野生菌株，本實驗室保存。Pf6285，rsmZ突變菌株；PfΔrsmY，rsmY突變菌株；PfΔrsmYΔrsmZ，rsmY和rsmZ雙突變菌株。突變菌株均由本研究所構建。

pRK2073，三親雜交輔助質粒；pJQ200SK，敲除用質粒;穿梭質粒pBBRM1CS-5，過表達用質粒。

1.1.2 培養基

采用LB培養基(包括液態和固態)。配制培養基的蛋白胨、酵母提取物以及瓊脂糖購自Oxoid公司。培養基中抗生素使用濃度：氨芐青霉素，100μg/mL；慶大霉素，50μg/mL；卡那霉素，50μg/mL；大觀霉素，100μg/mL。

1.1.3 試劑

實驗中所用的各種酶，包括限制性內切酶、Taq酶等都購自寶生物工程(大連)有限公司。質粒提取試劑盒以及細菌總DNA提取試劑盒購自OmegaBio-Tek公司，反轉錄試劑盒購自ThermoFisherScientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 rsmY及rsmZ基因敲除

利用二次同源重組的辦法，以蔗糖作為負篩選標記，采用敲除質粒pJQ200SK進行無痕敲除，只將整個目標基因序列敲除，而不影響其他基因序列。首先采用融合PCR手段將rsmY上下游序列整合在一起，然后將缺失rsmY序列的ΔrsmY序列與pJQ200SK載體連接，通過三親雜交方式轉入野生型Pf-5，ΔrsmY序列通過同源重組的方法將野生型的rsmY序列置換，就構建成了ΔrsmY突變菌株(命名為PfΔrsmY)。用同樣方法構建rsmZ突變菌株(命名為Pf6285)和rsmY/rsmZ雙突變菌株(命名為PfΔrsmYΔrsmZ)。

1.2.2 菌株生長曲線的制作

分別取野生菌株Pf-5和上述3種突變菌株在5mL的LB液體培養基中28 ℃、200r/min培養16h，然后測其OD600值。將各菌液的OD600值調為一致，按照1%的接種量轉接種于100mL的LB液體培養基中，28 ℃、200r/min培養，每隔2h取樣，測OD600值。以培養時間為橫坐標、菌液OD600值為縱坐標做生長曲線。

1.2.3 lacZ融合報告菌株的構建

lacZ融合載體的構建方法為：①以Pf-5基因組DNA為模板，進行PCR擴增lipA′-P(+6bp到+891bp)；②將擴增的lipA′-P片段用KpnI-HindIII進行雙酶切,然后與′lacZ(+22bp到+3110bp)片段進行酶連；③將lipA′-P與′lacZ連接成功的片段以及載體pJQ200SK進行SphI-BamHI雙酶切后連接；④將連接產物轉化至E.coliTop10后涂抗性平板；⑤通過菌落PCR鑒定陽性克隆子；⑥提取陽性克隆子的質粒并測序。將測序驗證正確的重組質粒命名為pJQ003，也就是lipA′-′lacZ融合質粒。

采用同樣的方法構建lipA-lacZ(lipA的序列為-16bp到+891bp，lacZ序列為-10bp到+3110bp)融合質粒pJQ004、rsmA′-′lacZ融合質粒pJQ005(rsmA′的序列為+6bp到+189bp)和rsmE′-′lacZ融合質粒pJQ006(rsmE′的序列為+6bp到+195bp)。通過三親雜交將pJQ003、pJQ004、pJQ005和pJQ006分別導入到Pf-5以及Pf6285、PfΔrsmY、PfΔrsmYΔrsmZ中構建染色體整合型lipA′-′lacZ翻譯融合報告菌株、lipA-lacZ轉錄融合報告菌株、rsmA′-′lacZ翻譯融合報告菌株和rsmE′-′lacZ翻譯融合報告菌株。

1.2.4 lipA的qRT-PCR

qRT-PCR實驗步驟如下：①將野生菌Pf-5和3種突變菌株分別接種于50mL的LB培養基中，28 ℃搖床培養至OD600約為5.7；②用RNApureBacteriaKit(DNaseI)試劑盒抽提總RNA；③對RNA質量進行檢測及定量；④根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明合成cDNA；⑤利用rpoD作為內參基因，分析lipA在不同突變株中的表達差異。

1.2.5 全細胞脂肪酶及β-半乳糖苷酶酶活測定

①將過夜培養的細菌培養物接種于50 mL LB培養基中，28 ℃或37 ℃培養12 h；②4 ℃、5000 r/min離心10 min收集菌體，用5 mL0.9%NaCl溶液重懸菌體，重復該步操作2次；③再用5 mL0.9%NaCl溶液重懸菌體，即得全細胞。全細胞脂肪酶酶活測定采用pNP法[9]，β-半乳糖苷酶酶活測定參照Miller法[10]。

2 實驗結果

2.1rsmY及rsmZ敲除結果

采用無痕敲除的辦法將目標基因序列完全敲除，同時不引入外源基因序列，通過蔗糖負篩選標記對突變株進行篩選，效果較好，如圖1所示。

1,2：rsmZ突變株；3：野生菌株；M：DNA marker

(a)rsmZ敲除

M：DNA marker；1：野生菌株；2：rsmY突變株

Fig.1ElectrophoretogramsofPCRproductsaftertheknock-out ofrsmZandrsmY

2.2rsmY及rsmZ敲除對細菌生長的影響

圖2為野生菌株和突變菌株的生長曲線。從圖2可以看出，rsmY、rsmZ單突變菌株的生長曲線和野生菌株的基本一致，而rsmY/rsmZ雙突變后，細菌的生長曲線與野生菌株的相差較大。雙突變菌株的生長速率變慢，穩定期后的OD600值也明顯下降，表明rsmY及rsmZ雙突變會影響細菌的生長，而rsmY和rsmZ相互之間可能存在互補的作用，因此，單突變任一基因對細菌的生長并未造成影響。

圖2 野生菌株和突變菌株的生長曲線

2.3rsmY及rsmZ敲除對Pf-5lipA表達的影響

為研究rsmY、rsmZ對lipA表達的影響，分別測定了rsmY和rsmZ單敲除以及雙敲除后全細胞脂肪酶的相對活性，結果見圖3。

圖3 野生菌株和突變株中全細胞脂肪酶的相對酶活

Fig.3 Relative enzyme activity of whole cell lipase in the wild and mutant strains

從圖3中可以看出，與野生菌株相比，不管是rsmY還是rsmZ單敲除，lipA的全細胞脂肪酶活性均有所下降；將兩個基因同時敲除后，lipA的全細胞脂肪酶活性急劇下降，其相對酶活只有野生菌株的17%左右。這是因為將rsmY和rsmZ敲除后，對細菌脂肪酶lipA表達的調控效應疊加，導致lipA的活性顯著降低。這個結果也說明rsmY和rsmZ能夠調控lipA的表達。

為了分析rsmY以及rsmZ是在轉錄水平還是在翻譯水平影響lipA的表達，分別構建了染色體整合型lipA-lacZ和lipA′-′lacZ的報告菌株，并分別測定了穩定期的野生型和突變株的β-半乳糖苷酶的酶活，結果見圖4和圖5。由圖可見，不管是在轉錄水平還是在翻譯水平，rsmY及rsmZ的敲除都會影響lipA的表達，但是在翻譯水平的影響更加明顯。

Pf-5F4：野生菌株融合lipA-lacZ； Pf6285F4：rsmZ突變株融合lipA-lacZ； PfΔrsmYF4：rsmY突變株融合lipA-lacZ； PfΔrsmYΔrsmZF4：rsmY/rsmZ雙突變株融合lipA-lacZ

圖4 染色體整合型lipA-lacZ轉錄融合報告菌株的β-半乳糖苷酶酶活

Fig.4β-galactosidaseactivityofchromosome-bornelipA-lacZtranscriptionalfusionreportstrains

Pf-5F3：野生菌株融合lipA′-′lacZ；Pf6285F3：rsmZ突變株融合lipA′-′lacZ；PfΔrsmYF3：rsmY突變株融合lipA′-′lacZ； PfΔrsmYΔrsmZF3：rsmY/rsmZ雙突變株融合lipA′-′lacZ

圖5 染色體整合型lipA′-′lacZ翻譯融合報告菌株的β-半乳糖苷酶酶活

Fig.5 β-galactosidase activity of chromosome-bornelipA′-′lacZtranslationalfusionreportstrains

為了進一步驗證lacZ融合的結果，利用qRT-PCR來進行分析，結果見圖6。由圖6可以看出，rsmY及rsmZ的敲除會影響lipA的表達，但轉錄水平上的mRNA含量并沒有急劇降低，這也說明了rsmY及rsmZ主要是在翻譯水平影響lipA的表達。

2.4 rsmY及rsmZ敲除對rsmA、rsmE的影響

本課題組前期研究[11]表明，在Pf-5中，是rsmE而不是rsmA與lipA的啟動子序列直接結合來調控lipA的表達；文獻[12]亦報道，在熒光假單胞菌CHA0中，rsmX/Y/Z能夠與RsmA及RsmE結合，阻斷RsmA、RsmE與調控基因的mRNA結合，從而能夠調控基因表達。因此下面進一步分析在Pf-5中rsmY、rsmZ主要是通過rsmA還是rsmE來調控lipA的表達。

圖6lipA在野生菌株和突變株中表達的qRT-PCR分析

Fig.6 qRT-PCR analysis oflipAexpression in the wild and mutant strains

染色體整合型rsmA′-′lacZ和rsmE′-′lacZ在野生菌株和突變菌株中的β-半乳糖苷酶酶活如圖7所示。由圖7可見，rsmY、rsmZ單敲除對rsmA和rsmE的表達影響均比較小，而雙敲除后，rsmA、rsmE的表達均有所提高，并且在對數生長后期以及穩定期，雙敲除突變株的rsmE表達急劇增加。

(a)rsmA′-′lacZ

(b)rsmE′-′lacZ

圖7rsmA′-′lacZ及rsmE′-′lacZ在野生菌株和突變菌株中的β-半乳糖苷酶酶活

Fig.7 β-galactosidase activity ofrsmA′-′lacZandrsmE′-′lacZinthewildandmutantstrains

3 討論

Rsm調控系統在細菌基因的表達調控中發揮著重要的作用。在P.protegensCHA0中，RsmE和RsmA能與rsmX/Y/Z的GGA區域結合，從而阻斷RsmA、RsmE與調控基因的mRNA結合[7]。因此，在Rsm調控系統中，rsmX/Y/Z是與RsmA以及RsmE協同發揮調控作用的。而在P.protegensPf-5中也包含RsmA和RsmE，而且RsmE與lipA的啟動子區域結合來調控lipA的表達[11]，因此，有必要深入研究rsmY、rsmZ影響lipA表達的分子機理。

本研究通過將rsmY、rsmZ基因敲除，并分析lipA的全細胞脂肪酶活性以及染色體整合型lipA-lacZ、lipA′-′lacZ、rsmA′-′lacZ、rsmE′-′lacZ的β-半乳糖苷酶酶活，發現rsmY、rsmZ主要在轉錄后水平影響lipA的表達。另外，rsmY、rsmZ均抑制rsmA、rsmE的表達。rsmY、rsmZ敲除后，rsmA、rsmE的表達水平均提高，而rsmE的表達則是顯著提高，這些結果表明rsmY和rsmZ對rsmE的影響要明顯高于其對rsmA的影響。結合前期研究結果可以推測，rsmY、rsmZ主要是通過影響rsmE的表達來調控lipA的表達。而在Pf-5的近緣菌株P.protegensCHA0中，rsmA、rsmE均可以與rsmY、rsmZ結合，但rsmA的表達強度要遠高于rsmE的表達強度，而且rsmA的表達從對數生長期開始一直持續至穩定期，而rsmE的表達則是從對數生長后期開始直至穩定期。

另外，在Pf-5中，rsmE的表達強度和表達差異性高于rsmA，這也可能是rsmY/Z選擇通過rsmYZ/RsmE/LipA途徑激活lipA翻譯而不選擇通過rsmYZ/RsmA/RsmE/LipA途徑來抑制lipA翻譯的原因。結合已有的研究結果可以進一步證實rsmY、rsmZ與rsmA、rsmE的相互關系，更加明確Rsm調控基因表達的分子機理。

4 結語

本文通過rsmY、rsmZ基因敲除構建防御假單胞菌Pf-5的突變株，分析野生菌株和突變株中lipA的全細胞脂肪酶活性及染色體整合型lipA-lacZ、lipA′-′lacZ、rsmA′-′lacZ、rsmE′-′lacZ的β-半乳糖苷酶酶活，并采用qRT-PCR等分析手段，首次證明了在Pf-5中，rsmY、rsmZ在翻譯水平抑制rsmA和rsmE的表達，而且主要是通過抑制rsmE的翻譯來激活lipA翻譯，從而調控lipA的表達。這些結果可為進一步研究脂肪酶lipA的表達調控機制、構建脂肪酶高效表達的基因工程菌提供新的思路和方法。

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[責任編輯 尚 晶]

Effect of Rsm regulatory system on the expression of lipase inPseudomonasprotegensPf-5

LiMenggang,YanYunjun

(College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China)

Rsm system is a very important expression regulation factor for bacterial genes. This study focused onPseudomonasprotegensPf-5. Through the knockout ofrsmYandrsmZgenes, thersmYmutant,rsmZmutant andrsmY/rsmZdouble mutant were constructed. The relative whole-cell lipase activities oflipAand β-galactosidase activities of chromosome-bornelipA-lacZ,lipA′-′lacZ,rsmA′-′lacZandrsmE′-′lacZfusions in the wild and mutant strains were analyzed. The results show thatrsmYandrsmZmainly affect the expression oflipAat the post-transcriptional level. Moreover, bothrsmYandrsmZinhibit the expression ofrsmAandrsmE, and the knockout ofrsmYandrsmZcan slightly improve the expression level ofrsmAand significantly enhance that ofrsmE. In conclusion,rsmYandrsmZhave greater influence onrsmEthan onrsmA, and they regulate the expression oflipAin Pf-5 mainly through affecting the expression ofrsmE.

gene expression regulation; lipase;Pseudomonas; Rsm; gene knockout; small RNA

2017-04-20

國家自然科學基金資助項目(31070078)；湖北省自然科學基金重點項目(2015CFA085).

李猛剛(1982-)，男，華中科技大學博士生. E-mail:menggang2004@163.com

閆云君(1969-)，男，華中科技大學教授，博士生導師. E-mail:yyyunjun@163.com

10.3969/j.issn.1674-3644.2017.04.007

Q784

A

1674-3644(2017)04-0274-05