評價中藥早期心、肝、腎毒性的生物標志物的研究概況

李煦照 張帥男貴陽中醫學院藥學院，貴州 貴陽 550025

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評價中藥早期心、肝、腎毒性的生物標志物的研究概況

李煦照 張帥男*
貴陽中醫學院藥學院，貴州 貴陽 550025

筆者對一些中藥早期心、肝、腎毒性的生物標志物及相關代謝途徑進行綜述，并將這些生物標志物進行分類。目前已知的生物標志物主要分為糖代謝類(2種)、脂類(10種)、磷脂類(5種)、氨基酸類(11種)、類固醇類(1種)、有機酸類(20種)、鞘脂類(1種)和其他類(11種)。這些代謝物可以用于靶標代謝組學對中藥毒性進行評價。目前，應用代謝組學來評價中藥毒性尚需完善具體的評價體系和評價標準、才能達到控制中藥劑量降低中藥毒性的目的。

中藥；毒性；代謝組學；生物標志物

隨著中藥在世界上應用日漸廣泛，其安全性也受到了國內外的普遍重視。因為中藥復雜的成分既可以作用在治療靶點上，也可以作用在毒性靶點上。因此，中藥在治療疾病的同時，也可能會產生潛在的毒性[1]。由于急性、亞急性、長期毒性實驗主要集中于檢測組織形態學改變和生化指標，但是并未從整體觀點闡明中藥對機體的生化過程所形成的內源性代謝物和外源性代謝物對毒性的影響和影響規律[2]。所以，尋找一種快速、準確、敏感的方法來評價外源性化合物對生物體的毒性作用，已成為當前中藥安全性評價亟待解決的重要問題[3]。代謝組學是一門新發展的技術，主要研究生物體由病理生理刺激或遺傳因素改變所致內源性代謝產物的變化[4]。代謝組學從研究生物體整體代謝變化出發，全面反映藥物作用后生物體內各個組織器官代謝的變化，并可發現藥物毒性及不良反應的情況。因此，代謝組學作為毒理學研究中一種重要的手段，開始應用于藥物毒性早期評價及其機制研究等多項領域[3]。目前，基于代謝組學技術的中藥肝毒性、腎毒性、心臟毒性等安全性評價研究已成為中藥毒理學的研究熱點。因此，中藥毒性生物標志物是評價中藥毒性的關鍵指標。筆者綜述了中藥毒性相關生物標志物研究進展，為利用靶標代謝組學評價中藥毒性提供參考。

1 中藥腎毒性相關生物標志物

腎臟不僅是排泄藥物的主要器官，也是藥物毒性作用的重要靶器官。王清秀等[5]利用NMR技術研究大黃素處理后大鼠尿液、血漿和腎臟組織萃取物中內源性代謝產物譜的變化，發現血漿中肌氨酸、異丁酸鹽和 3-羥基丁氨酸升高，而乳酸、丙氨酸、酪氨酸、膽堿、磷酸卵磷酯、葡萄糖、VLDL/LDL(CH2)等明顯下降；而尿液中肌酐、肌酸、TMAO、醋酸鹽、乳酸、葡萄糖和各種氨基酸含量明顯升高,檸檬酸鹽、馬尿酸、2-酮戊二酸、?；撬岷透拾彼岷克较陆怠Ｄ蛞褐衅咸烟呛桶被嵘呤悄I小管損傷的典型標志；腎組織萃取物中醋酸鹽、3-HB、肌酐、肌酸明顯增加，而乳酸和膽堿、磷酸卵磷脂下降。由此推測大黃素可導致脂類成分的改變，破壞細胞膜性結構,最終導致腎小管上皮細胞受損而致重吸收障礙。但是損傷是輕微的，結束藥物暴露后，損傷能夠得到恢復。尿液中的氨基酸，葡萄糖，TMAO以及肌酐可以作為大黃素腎毒性的主要生物標志物研究。趙劍宇等[6]研究經關木通染毒后大鼠尿液的代謝表型改變及其與組織病理和尿液、血漿生化指標的相關性，結果尿樣中氧化三甲胺、檸檬酸、?；撬?、肌酐、甜菜堿等代謝物均有不同程度的下降，而醋酸、丙氨酸則明顯上升。其中，醋酸、氧化三甲胺都是腎毒性的生物標志物[7-10]。常麗娟等[11]利用UFLC/MS-MS分析雷公藤乙醇提取物組致大鼠的血清中小分子代謝物的變化，發現血清中二甲基甘氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和甘油二酯等 9 種代謝物有統計學差異，鑒定其為雷公藤致腎毒性的生物標記物。研究表明[12]高濃度的二甲基甘氨酸可有效抑制 BHMT 活性，使高半胱氨酸升高，而高半胱氨酸會導致腎功能衰竭和高同型半胱氨酸血癥的發生。西藥的腎毒性生物標志物對研究中藥腎毒性生物標志物也有參考價值。Zhao T等[13]運用代謝組學研究鏈脲霉素所導致的腎毒性，其通過超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用( UPLC-QTOF/MS) 和 PLS-DA分析發現馬尿酸、硫酸吲哚酚、吡哆酸、山梨醇和 N-乙酰葡萄糖是其腎毒性的生物標志物。Ma等[14]發現尿液的分析結果顯示牽牛子乙醇提取物改變了氨基酸、檸檬酸、肌酐、膽酸、5-甲基四氫葉酸在尿液的濃度。Gu L等[15]運用代謝組學研究馬錢子的毒性，發現馬錢子組大鼠血清肌酐、尿酸水平明顯上升，同時胍基丁二酸、胍乙酸、3-羥基吲哚硫酸鹽和吲哚乙酸的水平也高于空白組，這表明氨基酸的代謝異常。詳見表1。

表1 中藥腎毒性生物標志物

續表

表1 中藥腎毒性生物標志物

2 中藥肝毒性相關生物標志物

肝臟是人體的主要代謝器官，也是藥物代謝的主要場所。因此，在藥源性不良反應中，肝損傷是最常見不良反應之一。當前，藥源性肝損害( Drug-induced Liver Injury，DILI) 已成為臨床較常見的、易產生嚴重后果的藥源性疾病[16]。在我國，因使用中藥而產生的急慢性肝損害的臨床報道呈逐年上升趨勢，一些傳統并不認為是毒劇藥的中藥如何首烏等甚至有中毒致死的報道[16]。代謝組學發現可能成為新的藥源性肝損傷生物標志物主要有血清視晶酸(Ophthalmic Acid)、尿液中的8’-羥基-2’-脫氧鳥苷(8-OHdG)和辛酰肉堿(Octanoylcarnitine)以及血漿和尿液中的膽汁酸等[17]。藥物通過代謝途徑導致肝損傷的機制主要有影響肝代謝過程中的三羧酸循環，比如：乳酸、丙氨酸、肌酐的增加可預測肝毒性[18]。Shima等[19]利用 CE-MS/MS 結合 GC-TOF-MS 發現延胡索酸是甲基苯丙胺所致肝毒性的潛在生物標志物，甲基苯丙胺通過影響三羧酸循環過程干擾糖酵解、氧化磷酸化及脂肪酸的 β-氧化過程產生肝臟毒性。劉曉燕等[20]利用對乙酰氨基酚、四氯化碳、大黃素、雷公藤甲素和馬兜鈴酸構建不同類型的肝細胞損傷模型，利用超高效液相色譜-質譜聯用技術(UPLC-MS)分別得到正常組和損傷組的細胞代謝輪廓譜(如圖1a，1b)，發現了14種潛在肝毒性生物標志物：包括植烷酸、13，14-二羥基-二十二烷酸、2-羥基-植烷酸、2-羥基-二十二烷酸、13-二十二烯酸、13-十八烯醇、3-羥基-二十四烷酸、4-羥基-6-二十二烷酮、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、谷胱甘肽(GSH)、鞘氨醇、苯基甘氨酸和小肽。其中，植烷酸、13，14-二羥基-二十二烷酸、2-羥基-植烷酸、2-羥基-二十二烷酸、13-十八烯醇、3-羥基-二十四烷酸和 4-羥基-6-二十二烷酮均為脂類，其含量明顯升高。脂類化合物的顯著變化表明藥物肝毒性擾亂了肝細胞內長鏈脂肪酸的正常代謝，尤其是脂肪酸的氧化過程。趙小梅等[21]篩查雷公藤多苷片所致的肝毒性損傷，分析鑒定了7 個代謝物，分別為 6-磷酸葡萄糖胺、溶血磷脂、色氨酸、胍基乙酸、3-吲哚丙酸、可的松和泛醌，其代謝水平的變化表明氨基酸代謝、糖代謝、磷脂代謝和激素代謝等途徑發生紊亂，由此推測雷公藤多苷片致肝損傷可能與三羧酸循環中能量代謝和尿素循環中氨基酸代謝以及糖代謝異常有關(損傷機制如圖2)。盛云華等[22]通過代謝組學檢測發現黃藥子組大鼠血清中α-葡萄糖、β-葡萄糖降低，三甲胺、谷氨酸、脂質(LDL/VLDL)、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿升高。黃藥子組大鼠的尿液中m-羥基苯乙酸、苯乙酰甘氨酸、丙酮酸、丙二酸二甲酯和α-羥基丁酸、丙氨酸和乙酸、牛磺酸、乙酰乙酸、N-乙酰谷氨酸、N-甲基煙酰胺降低，馬尿酸、α-羥基異戊酸、煙堿酸、p-羥基苯乙酸、三甲胺、二甲胺、丙二酸升高。這些代謝物異常表達反映出了糖脂代謝異常、脂類物質蓄積等肝損傷跡象。謝彤等[23]基于氣質聯用法對雷公藤組大鼠血漿進行代謝組學研究，發現雷公藤組中生糖氨基酸包括丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸等水平顯著升高，支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨基酸水平下降，說明了雷公藤肝臟毒性的發生與氨基酸代謝，能量代謝等過程密切相關。馬致潔等[24]采用液相色譜-質譜方法測定服用何首烏組大鼠的血清代謝指紋譜，共篩選得到6個潛在生物標志物: oleamide、lyso PC(16:0)、 leukotriene A4、trans-tetra-dec-2-enoic acid、dihydrocortisol 和 7a-hydroxydehydroepiandrosterone，這些標志物在何首烏致肝損傷動態過程中呈現一定的變化趨勢。中藥肝毒性生物標志物見表2。

圖1 對乙酰氨基酚、四氯化碳、大黃素、雷公藤甲素和馬兜鈴酸干預后肝細胞代謝譜的PCA(1a)和PLS-DA(1b)分析結果[20]

圖2 雷公藤致大鼠肝損傷后所影響的生化通路圖[21]

表2 中藥肝毒性生物標志物

續表

表2 中藥肝毒性生物標志物

3 中藥心臟毒性相關生物標志物

何家樂等[25]運用 UPLC-Q-TOF/MS 技術研究人參與附子配伍對大鼠血清中內源性標記物的影響,發現參附合并組中，谷胱甘肽、磷脂酰膽堿、檸檬酸含量下降，同時抗壞血酸、尿酸、D-半乳糖、色氨酸、L-苯丙氨酸的含量上升，說明參附合煎液中附子對心臟產生了毒性影響。有研究顯示[26]，當心血管系統受到損傷的時候，檸檬酸含量下降并且糖類和氨基酸水平升高。當心肌缺血，心肌能量供應不足的時候，ATP 降解產物次黃嘌呤、黃嘌呤增多，在代謝為最終產物尿酸的過程中，產生大量的 ROS(細胞內氧自由基)。因此尿酸水平的增加，預示著 ROS的大量產生以及心肌缺血的出現。有研究顯示[27-29]，心血管疾病進程中氧化應激損傷是一個很重要的機制，而抗氧化劑對此有抑制作用。采用斑馬魚作為模式動物，研究阿司咪唑對心臟毒性的生物標志物可以為研究中藥的心臟毒性提供參考。韓利文[30]等采用阿司咪唑處理發育48hpf( Hours Post Fertilization) 斑馬魚幼魚，代謝組學分析結果顯示，斑馬魚體內葡萄糖、甘氨酸、乳酸肌肝、谷氨酰胺、N-乙酰-L-賴氨酸、L-脯氨酸、檸檬酸、L-酪氨酸、磷酸、膽固醇、棕櫚酸等12 種代謝物發生了明顯變化，說明心肌損傷可能與乳酸代謝障礙和氨基酸代謝紊亂、脂肪酸代謝異常有關。目前已發現附子、阿霉素(DOX)、異丙腎上腺素(ISO)作為毒性誘因的心臟毒性生物標志物共有五大類[31]，分別是脂肪酸類、磷脂類、氨基酸及其衍生物、類固醇類和激素類衍生物、其他小分子代謝物，這些代謝物為研究中藥心臟毒性提供了參考和依據。中藥心臟毒性生物標志物見表3。

表3 中藥心臟毒性生物標志物

4 小結與展望

近年來，代謝組學發展迅速，在中藥毒理學應用中展現出明顯優勢。細胞代謝組學、血液代謝組學和尿液代謝組學的組合應用可以用于早期篩查中藥的心、肝、腎毒性，以及為臨床的心、肝、腎損傷提供較全面的診斷和治療信息。文章總結了評價中藥早期心、肝、腎毒性的生物標志物，并進行了歸類和總結。但是代謝組學的應用仍有一定的局限性：目前已發現的生物標志物的活性尚未全部明晰，給中藥毒性評價帶來一定的障礙。代謝組學仍需要配合蛋白質組學、病理學等其他實驗方法來驗證其評價結果的準確性。代謝組學的研究目前欠缺系統性，在中藥毒性的評價上仍需完善。在中藥毒性評價研究中，可采用靶標代謝組學的研究方法，有目的地檢測尿液、血液中各類生物標志物的表達量，具體評價中藥的毒性程度。靶標代謝組學方法將會通過一系列檢測方案并結合多種檢測方法(比如蛋白質組學和基因組學)對中藥的毒性進行快速、高效、準確的評價和篩查。

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The Research Survey of Evaluation Early Stage Toxicity Biomarkers of Heart,Liver and Kidney of Traditional Chinese Medicines

LI Xuzhao ZHANG Shuainan*

Pharmacy School,Guiyang University of Chinese Medicine,Guiyang 550025,China

This article reviewed a variety of biomarkers of heart, liver and kidney toxicity of some Traditional Chinese Medicines (TCM) and related metabolic pathways. And the biomarkers had been classified into 8 sorts. The known biomarkers had been mainly divided into glycometabolism (2 kinds), lipid (10 kinds), phospholipids (5 kinds), amino acid (11 kinds), steroid (1 kind), organic acid (20 kinds), sphingolipid (1 kind), other (11 kinds). The biomarkers could be applied in TCM toxicity evaluation by target metabolomics. So far, the specify evaluation system and standard will be needed in TCM toxicity evaluation by metabolomics to control the dosage of TCM and reduce the toxicity of TCM.

Traditional Chinese Medicine; Toxicity; Metabolomics;Biomarker

邱德文全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目；貴陽中醫學院博士啟動金(2015,2016)。

李煦照(1986-)，男，漢族，副教授，研究方向為系統藥理學。E-mail：xuzhaoli86@yeah.net

張帥男(1987-)，女，漢族，副教授，研究方向為系統毒理學。E-mail：laurahoney@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)12-0047-07

2017-04-12 編輯：陶希睿)