竹黃顆粒介導IL-22/miR-330調控角質形成細胞增殖的機制研究

沈 慧，劉 文，姚小磊，楊志波*

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011）

竹黃顆粒介導IL-22/miR-330調控角質形成細胞增殖的機制研究

沈 慧1,2，劉 文1，姚小磊2，楊志波1*

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011）

目的研究竹黃顆粒干預IL-22/miR-330調控角質形成細胞增殖的分子機制。方法IL-22處理HaCaT和HKCs細胞,應用QPCR技術檢測細胞中miR-330的表達變化；之后慢病毒感染HaCaT和HKCs細胞，實現miR-330的過表達和干擾，通過CCK8和BrdU技術檢測細胞增殖情況；采用CCK8、Western blot、QPCR、ELISA實驗分別檢測不同濃度竹黃顆粒處理HaCaT、HKCs后細胞增殖能力，IL-22蛋白表達水平，miR-330表達水平及細胞分泌IL-22含量的變化。結果IL-22處理后的HaCaT和HKCs細胞中miR-330的表達水平顯著下調（P＜0.01），而細胞增殖能力顯著提升（P＜0.01）；過表達miR-330后 HaCaT和HKCs細胞增殖能力顯著下降（P＜0.05），干擾 miR-330后 HaCaT和HKCs細胞增殖能力顯著上升（P＜0.05）；竹黃顆粒處理HaCaT、HKCs后，細胞增殖能力下降（P＜0.01），IL-22蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01），miR-330表達水平顯著上升（P＜0.01），細胞分泌IL-22含量顯著下降（P＜0.01）。結論竹黃顆粒可以通過抑制IL-22的表達，促進miR-330的表達，從而抑制角質形成細胞增殖。

銀屑病；竹黃顆粒；IL-22；miR-330；角質形成細胞

最早關于“銀屑病”的記載可見于隋代巢元方所著《諸病源候論》一書[1]，明代儒醫李梃在《醫學入口》中首度提出癬病的發生，是由于患者素有“血分熱燥”的內在病因，以至“風毒”之邪容易入侵“客于皮膚”，內外相合而致病的特點[2]。明清醫籍中，對于本病病因病機的分析，諸位醫家依然秉持著：內外因相互結合導致銀屑病發生的觀點，內因主要責之患者血分病變。

白細胞介素22（IL-22）與銀屑病存在重要的關系，可以誘導角質形成細胞釋放出一系列的細胞因子，如 IL-8、IL-23、IL-6、IL-21 等，炎癥因子的釋放可加劇炎癥反應，進一步促進表皮層增殖以及棘層增厚[3]。多項研究結果表明銀屑病患者的外周血血清中IL-22的表達水平與銀屑病皮損區面積和病情嚴重程度指數呈現正相關[4-8]。Ma等[9]借助自體免疫性銀屑病模型進行研究，結果發現抗IL-22的抗體可以抑制角化細胞和上皮細胞分泌炎癥介質。由此可見在銀屑病的發生發展過程中，存在炎癥因子的不斷釋放及炎癥反應的持續發生，而在這一過程中IL-22起著關鍵的促進作用，且其作用的靶點細胞是角質形成細胞。miRNA是近年來科學家發現的具有生物學調控功能的一種非編碼小分子RNA。與銀屑病相關的miRNAs分子中，有一些是重要的生長發育調控因子，受到廣泛的關注和研究，如miR-203、miR-21、miR-146a和miR-125b等[10]。楊志波等[11]應用miRNA及基因芯片技術并結合生物信息學預測技術，成功構建了銀屑病相關miRNA與靶基因及基因功能調控網絡，證明特異性表達的miRNA可以通過靶向結合而調節其靶基因的表達變化，并通過靶基因的功能進一步調控銀屑病的發生及發展過程。之后進一步補充和完善了前期構建的銀屑病差異表達miRNA與靶基因及基因功能調控網絡，預測了一批前期未研究過的miRNAs分子，miR-330就是預測的結果之一推測miR-330可能在銀屑病發病機制中發揮重要功能。竹黃顆粒在臨床治療銀屑病中表現出較好的療效，且提取物可以抑制角質形成細胞的增殖。竹黃顆粒劑可以通過調節人體外周血中IL-6、TNF-a的表達水平來治療銀屑病[12]；還可以顯著降低血漿和銀屑病皮損組織中β-內啡肽的含量，進而抑制炎癥因子的產生[13]。已證實竹黃顆粒對銀屑病患者皮損組織中多個miRNAs分子具有顯著調節作用，如miR-192、miR-3175、miR-194、miR-18a、miR-21、miR-629、miR-25、miR-199a-5p、miR-100、miR-99a、miR-125b、miR-409-3p、miR-99b 等[14]。

本研究將進一步驗證竹黃顆粒與IL-22、miR-330之間的調控關系，以期為銀屑病的治療提供新的靶點及科學思路。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人角質形成細胞HaCaT（HaCaT immortalized human epidermal cells）和 HKCs （human keratinocytes）細胞株均購自長沙贏潤生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

二甲基亞砜購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；RPMI 1640培養液購自Hyclon公司；LV-miR-330慢病毒、LV-miR-NC慢病毒、LV-anti-miR-330慢病毒、LV-anti-NC慢病毒購自YRBIO公司，GAPDH一抗、IL-22一抗購自Abcam公司；CCK8試劑盒購自Sigma公司。

竹黃顆粒劑由湖南中醫藥大學第二附屬醫院制劑室生產，批號：20020921，規格：10 g/包，每包相當于生藥含量6.25 g。主要成分為：淡竹葉、生石膏、黃芩、黃連、黃柏、梔子、漏蘆、水牛角、生地黃、柴胡、白芍、當歸、黨參、麥冬、三七等。

1.3 細胞處理方法

1.3.1 細胞傳代培養 人角質形成細胞HaCaT和HKCs分別在T25培養瓶中傳代培養，細胞培養箱參數設定為37℃、5%CO2、飽和濕度。用顯微鏡觀察細胞的生長狀態，貼壁細胞生長達80%融合度時，按細胞數目1∶3的比例進行后續傳代培養。

1.3.2 IL-22處理細胞 將IL-22分別溶解于無菌水中，制備成 10 mg/mL的儲液，用 0.2 μm的細菌濾器在無菌環境下過濾除菌，于-20℃凍存。實驗中根據每組細胞中具體的體積添加IL-22儲液使培養基終濃度為100 ng/mL，對照組加相同體積的無菌水。

1.3.3 慢病毒感染細胞 將HaCaT和HKCs細胞分別傳接種T25細胞瓶或96孔板中,于37℃ CO2培養箱中培養過夜,按 LV-miR-330、LV-miRNC、LV-anti-miR-330、LV-anti-NC 分組分別在各組細胞中以1×107TU滴度添加慢病毒 （按體積比1∶100 添加）。

1.3.4 竹黃顆粒處理細胞 竹黃顆粒溶解在RPMI1640培養液中，調節 pH值至 7.0，用 0.2 μm細菌濾器過濾，制備成1 g/mL的儲液，于4℃保存。實驗中根據每組細胞中具體的體積添加終濃度為10、20、40 mg/mL的竹黃顆粒溶液，對照組細胞中加相同體積的RPMI 1640培養液，繼續培養；根據后續實驗的需求，在不同時間點收集各組細胞進行相關檢測。

1.4 檢測實驗

1.4.1 QPCR（real-time quantitative PCR）實驗 經藥物或其它因子處理后48 h用胰酶消化收集細胞，PBS漂洗2遍；分別提取各組細胞中的總RNA，經逆轉錄獲得相應的cDNA，最后制備QPCR反應體系上機檢測。反應程序設定為：95.0℃ 2 min；95.0 ℃ 15 s；61.0 ℃ 30 s；72.0 ℃ 20 s；然后讀取數值；運行40個循環；95.0℃ 10 s；熔融曲線60.0℃至95.0℃；擴增0.5℃ 5 s；最后讀取數值。根據Ct值，計算各基因相對表達量。

1.4.2 CCK8（cell couting kit-8）實驗 CCK8實驗主要用于檢測細胞的增殖活力。將待測細胞接種于96孔細胞培養板中，24 h后向細胞培養版中添加藥物或因子，繼續培養，實驗分組平行設置24 h、48 h和72 h三個時間點，到相應時間點向每孔細胞中加入10 μL CCK溶液，混勻后在37℃恒溫培養箱中孵育4 h后，用多功能酶標儀檢測各組樣品在490 nm處的吸光值。

1.4.3 BrdU（5-brano-2-deoxyuridine）實驗 BrdU實驗主要用于檢測細胞的增殖。將待測細胞接種于96孔細胞培養板中，24 h后向細胞培養板中添加藥物或因子，繼續培養，實驗分組平行設置24 h、48 h和72 h三個時間點，到相應時間點向每孔細胞中加入20 μL BrdU標記液，繼續培養6 h，再分別加入Fix Denat使DNA變性，然后加100 μL HRP標記的抗BrdU抗體，洗滌3次后加入100 μL TMB底物液顯色，靜置20 min后加H2SO4終止反應并振蕩1 min，最后用多功能酶標儀檢測各組樣品在450 nm處的吸光值。

1.4.4 Western blot實驗 將待測細胞接種于T25細胞培養瓶中，24 h后添加藥物或因子，繼續培養至 48 h，收集各組細胞并提取總蛋白進行定量分析，制備蛋白電泳樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，依次進行轉膜-封閉-洗膜-雜交一抗-洗膜-雜交二抗-洗膜-顯影定影。選用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內參分析目的蛋白的相對表達水平。

1.4.5 ELISA實驗 細胞處理及時間點與Western blot實驗一致，48 h后收集細胞上清，2 000 r/min離心5 min除去細胞碎片，取上清用IL-22 ELISA檢測試劑盒測定IL-22蛋白含量。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0統計學軟件對實驗結果進行統計學分析。計量資料用“±s”來表示，然后用Levene法進行方差齊性檢驗。兩個獨立樣本均數比較呈現正態分布的采用t檢驗數據，非正態分布的則采用非參數Mann-Whitney檢驗數據；多個獨立樣本均數的比較呈現正態分布的采用方差分析，非正態分布的則采用秩和檢驗；P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-22模擬的炎癥微環境下miR-330表達水平檢測

應用IL-22模擬銀屑病炎癥微環境后，HaCaT和HKCs細胞體外培養狀態良好，細胞貼壁狀態正常，分布均勻 （見圖1）。QPCR檢測結果如圖2所示，在HaCaT細胞中，添加IL-22組相對于正常組細胞，miR-330的表達水平下調約50%，差異具有統計學意義（P＜0.01）；在 HKCs細胞中，添加 IL-22組相對于正常組細胞，miR-330的表達水平下調約70%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。說明在炎癥微環境下人角質形成細胞中miR-330的表達水平被顯著抑制。

圖 1 顯微鏡下 HaCaT（A）和 HKCs（B）細胞培養形態圖（×200）

圖2 IL-22模擬的炎癥微環境下miR-330表達水平檢測結果

2.2 miR-330過表達及干擾慢病毒感染鑒定結果

將 LV-miR-330、LV-miR-NC、LV-anti-miR-330、LV-anti-NC 4 種慢病毒按“1.3.3”中描述的步驟分別感染HaCaT和HKCs細胞。QPCR結果如圖 3所示，LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細胞中miR-330的表達水平分別上調約22倍和16倍，差異具有統計學意義（P＜0.01）；LV-ant-miR-330組相對于LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細胞中miR-330的表達水平分別下調約75%和65%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。4種慢病毒的感染結果均符合預期，可以滿足后續實驗要求。

圖3 miR-330過表達及干擾慢病毒感染鑒定結果

2.3 IL-22模擬的炎癥微環境下miR-330對角質形成細胞增殖的影響

2.3.1 CCK8實驗檢測IL-22及過表達/干擾miR-330對細胞增殖的影響 CCK8實驗檢測結果如圖4和圖5所示。在不加IL-22的細胞中，LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細胞的增殖能力均被抑制，差異具有統計學意義（P＜0.05）；在添加IL-22的細胞中，LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細胞的增殖能力同樣被抑制，差異具有統計學意義（P＜0.01）。說明過表達miR-330可以抑制人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖能力。加IL-22組細胞相對于不加IL-22組細胞，增殖能力顯著提高 （P＜0.01）；在不加IL-22的細胞中，LV-ant-miR-330組相對于LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細胞的增殖能力均有所提高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；在添加 IL-22 的細胞中，LV-ant-miR-330組相對于LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細胞的增殖能力同樣有所提高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。說明干擾miR-330可以促進人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖；IL-22可以促進人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖。

圖4 IL-22及過表達miR-330對細胞增殖的影響

圖5 IL-22及干擾miR-330對細胞增殖的影響

2.3.2 BrdU實驗檢測IL-22及miR-330對細胞增殖的影響 BrdU實驗檢測結果如圖6所示，加IL-22組細胞相對于不加IL-22組細胞，增殖能力顯著提高（P＜0.01）；LV-ant-miR-330 組相對于 LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細胞的增殖能力有所提高，差異具有統計學意義 （P＜0.05）；LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細胞的增殖均被抑制，差異具有統計學意義（P＜0.05）。說明miR-330是人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖抑制因子；IL-22是人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖促進因子。

圖6 BrdU實驗檢測IL-22及miR-330對細胞增殖的影響

2.4 竹黃顆粒對角質形成細胞中IL-22/miR-330的表達變化的影響

2.4.1 竹黃顆粒對角質形成細胞增殖的影響CCK8檢測結果如圖7所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細胞的增殖被顯著抑制（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，增殖抑制越明顯。說明竹黃顆粒可以抑制人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖。

圖7竹黃顆粒對角質形成細胞增殖的影響

2.4.2 竹黃顆粒對角質形成細胞IL-22蛋白表達水平的影響 Western blot實驗檢測細胞中IL-22的蛋白表達變化，結果如圖8所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細胞中的IL-22蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，下降趨勢越明顯。說明竹黃顆粒可以抑制人角質形成細胞HaCaT和HKCs中IL-22蛋白的表達水平。

2.4.3 竹黃顆粒對角質形成細胞IL-22分泌水平的影響 ELISA實驗檢測上清中炎癥因子IL-22的含量，結果如圖9所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細胞上清中的IL-22的含量顯著下降（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，下降趨勢越明顯。說明竹黃顆粒可以抑制人角質形成細胞HaCaT和HKCs分泌IL-22。

2.4.4 竹黃顆粒對miR-330表達水平的影響 QPCR實驗檢測細胞中miR-330的表達變化，結果如圖10所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細胞中的miR-330表達水平顯著上升（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，上升趨勢越明顯。說明竹黃顆粒可以上調人角質形成細胞HaCaT和HKCs的miR-330的表達水平。

3 討論

3.1 IL-22/miR-330與銀屑病

本實驗應用重組慢病毒技術在HaCaT和HKCs細胞中分別過表達和干擾miR-330的表達，結果顯示過表達miR-330可以抑制人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖；干擾miR-330可以促進人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖。上述研究結果均證實了miR-330可以抑制病變細胞的異常增殖，在銀屑病的檢測與治療中可以作為重要研發靶標。

圖8竹黃顆粒對角質形成細胞IL-22蛋白表達水平的影響

圖9竹黃顆粒對IL-22分泌水平的影響

圖10竹黃顆粒對miR-330表達水平的影響

機體內有促炎系統和抗炎系統，其反應程度及持續時間決定組織損傷修復的結局，兩者保持平衡狀態，但是如果炎癥反應沒有得到有效控制，進一步大規模發展則很可能加重組織損傷。當前認為炎癥、表皮細胞過度增殖和免疫學異常是銀屑病發病機制的三個中心環節。炎癥可能既是其發病的誘因，又是病情的主要癥狀，相互促進、相輔相成，這可能也是其病情難以根治的原因之一。本實驗中，IL-22可以顯著促進人角質形成細胞HaCaT和HKCs的增殖。炎癥因子刺激下，人角質形成細胞表現出活躍的增殖能力，若在正常機體中，很可能有其它相應的調控基因進行干預，阻止角質細胞的異常增殖；而在銀屑病患者體能，這種起關鍵作用的調控因子可能嚴重缺乏或活性喪失，導致角質細胞異常增殖，角質細胞的過量增殖會加重皮損，而皮損在缺乏控制的情況下會進一步促進炎癥反應及分泌炎癥因子。通過重組慢病毒技術進一步研究發現干擾miR-330的表達可以加強IL-22對角質形成細胞的增殖促進作用；過表達miR-330后可以減弱IL-22對角質形成細胞的增殖促進。這提示IL-22對角質形成細胞的調控很可能通過miR-330而實現，至于miR-330是否通過下游靶基因繼續發揮調控作用則需要進一步研究。

3.2 竹黃顆粒對IL-22/miR-330的調控

銀屑病中醫辨證以血熱型最為多見，一般認為本病多因素七情內傷或因體血熱，郁久化火，火熱亢盛，氣郁不舒。熱毒入里，伏于營血，導致血熱毒盛；病程日久，則生風化燥，風燥日久，則耗傷氣陰。本院歐陽恒教授主張“血熱毒滯”是誘發尋常型銀屑病的基本病機，并提出了“血熱陰耗證”，在治療方案中把益氣養陰和清熱解毒的理念融為一體，創立了竹黃顆粒。竹黃顆粒由淡竹葉、黃芩、黃柏、生石膏、梔子、黃連、水牛角、漏蘆、柴胡、生地黃、白芍、黨參、麥冬、當歸、三七等藥物組成，具有涼血活血、清熱解毒、益氣養陰之功效。本方切中尋常型銀屑病的基本病機，以清熱涼血解毒藥物為主，輔以益氣養陰，以防一味祛邪，耗傷正氣，臨床療效甚佳。

綜上，IL-22可以抑制miR-330的表達，促進角質形成細胞增殖；竹黃顆粒可以抑制IL-22的表達，促進miR-330的表達，抑制角質形成細胞增殖。

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（本文編輯 蘇 維）

Mechanism of Zhuhuang Granule Intervenes IL-22/miR-330 in Regulating Keratinocyte Proliferation

SHEN Hui1,2， LIU Wen1， YAO Xiaolei2， YANG Zhibo1*
（1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410005,China;2.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530011,China）

ObjectiveTo study the molecular mechanism of IL-22/miR-330 intervened by Zhuhuang granule in regulating the proliferation of keratinocytes.MethodsThe expression of miR-330 in HaCaT and HKCs cells after IL-22 intervention was detected by QPCR technique.Overexpression and interference of miR-330 in HaCaT and HKCs cells were achieved by lentivirus infection,their cell proliferation was detected by CCK8 and BrdU.The cell proliferation ability,the expression of IL-22 protein,the expression level of miR-330 and the secretion of IL-22 in HaCaT and HKCs were determined by CCK8,West ern blot,QPCR and ELISA,respectively.ResultsThe expression of miR-330 in HaCaT and HKCs cells significantly decreased after treatment with IL-22 (P＜0.01),and the cell proliferation ability of HaCaT and HKCs cells was significantly improved (P＜0.01).The cell proliferation ability of HaCaT and HKCs cells significantly decreased after miR-330 overexpression (P＜0.05).After interference of miR-330 expression,cell proliferation ability of HaCaT and HKCs had a significant increase (P＜0.05).Cell proliferation ability of HaCaT and HKCs treated by different concentrations of Zhuhuang granule decreased (P＜0.01).The expression of IL-22 protein decreased significantly(P＜0.01),the expression level of miR-330 increased significantly(P＜0.01),and the content of IL-22 decreased significantly (P＜0.01).Conclusion Zhuhuang granule could inhibit the expression of IL-22,promote the expression of miR-330 and inhibit the proliferation of keratinocytes.

psoriasis;Zhuhuang granule;IL-22;miR-330;keratinocytes

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.07.004

2017-05-11

國家自然科學基金面上資助項目（81573985）。

沈 慧，女，博士，主治醫師，主要從事中西醫結合防治銀屑病的研究。

*楊志波，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，E-mail：dr.yang888@126.com。

本文引用：沈 慧，劉 文，姚小磊，楊志波.竹黃顆粒介導IL-22/miR-330調控角質形成細胞增殖的機制研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（7）：708-714.