IFN—γ對奶牛乳腺上皮細胞轉分化的影響

孫俊若男 李海明 蘇韻 屈利娜 黨涵 楊磊

摘要 [目的]用轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導奶牛乳腺上皮細胞-肌纖維母細胞轉分化（EMT），以不同濃度的IFN-γ為阻斷劑，探討干擾素-γ（IFN-γ）對奶牛乳腺上皮細胞（BMEC）表型重塑的作用。[方法]將原代培養的BMEC分為對照組、誘導組（TGF-β1 10 ng/mL）、藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）及阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）。培養72 h后，觀察α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、結締組織生長因子（CTGF）和膠原I（COLⅠ α1）的mRNA相對表達量。[結果]誘導組α-SMA、CTGF和膠原I mRNA相對表達量顯著增加（P<0.05）；藥物組CTGF的mRNA相對表達量與對照組相比無顯著差異（P>0.05），α-SMA和COLⅠ α1 mRNA相對表達量顯著下降（P<0.05）；阻斷組IFN-γ明顯抑制了TGF-βl誘導的轉分化。[結論]IFN-γ能夠負性調控TGF-β1誘導的奶牛乳腺上皮細胞-肌纖維母細胞轉分化（EMT），減少COLⅠ α1分泌。

關鍵詞 TGF-β1；IFN-γ；奶牛乳腺上皮細胞；α-SMA；CTGF；膠原I

中圖分類號 S823.9+1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0099-03

Effects of Interferon-γ（IFN-γ） on the Transdifferentiation of Mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

SUN Junruonan， LI Hai-ming， SU Yun， YANG Lei* et al

（Orient Science & Technology College of Hunan Agricultural University， Changsha，Hunan 410128）

Abstract [Objective] Transforming growth factor-β1 （TGF-β1） was used to induce the transdifferentiation of mammary epithelial cells-myofibroblast cells of dairy cows. Taking different concentrations of IFN-γ as blocking agent， the effects of interferon-γ （IFN-γ） on the phenotypic remodeling of mammary epithelial cells of dairy cows were discussed. [Method] The mammary gland epithelial cells of primary culture were divided into control group，induced group （TGF-β1 10 ng/mL）， drug administration group （IFN-γ 20 ng/mL） and blocking groups（TGF-β1 10 ng/mL + IFN-γ 10，20，50，100 ng/mL） and cultured for 72 hours. mRNA expressions of α-SMA， CTGF and collagenⅠα1 were observed. [Result] mRNA relative expression quantity of a-SMA， CTGF and collagen I in induced group significantly increased （P<0.05）. Compared with control group， mRNA relative expression quantity of CTGF in drug administration group had no significant difference （P>0.05）， mRNA relative expression quantity of α - SMA and COL Ⅰ α1 significantly decreased （P<0.05）. IFN-γ obviously inhibited the transdifferentiation induced by TGF-β1 in blocking group. [Conclusion] IFN-γ can negatively regulate EMT induced by TGF-β1 and reduce the secretion of COL Ⅰ α1.

Key words TGF-β1；IFN-γ；Mammary epithelial cells of dairy cows；α-SMA；CTGF；Collagen I

IFN-γ是一種Thl型細胞因子，是由抗原、有絲分裂素等刺激，由活化的CD4+Thl、CD8+T細胞及自然殺傷細胞所分泌的一類可溶性糖蛋白，主要在單核細胞源樹突狀細胞和外周血單核細胞等抗原提呈細胞中表達。IFN-γ具有廣泛的免疫調節作用，包括對巨噬細胞、NK細胞、B細胞的膜分子表達、活化和分化的影響。

近些年，在肝臟組織的纖維化研究中發現IFN-γ能夠抑制肝臟星狀細胞（HSC）增殖，對抗ECM的合成，從而抑制肝臟纖維化[1-3]。在特發性肺損傷（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的研究中發現，IFN-γ能夠通過多種機制發揮抗肺纖維化作用。TGF-β的過量表達，是導致纖維化的主要誘因。在口腔黏膜瘢痕組織的研究中發現，IFN-γ在低劑量時能夠促進成纖維細胞增殖，在高劑量時主要起抑制作用。然而，關于在乳腺纖維化的進程中IFN-γ的作用則鮮見報道。

細胞外基質（Extracellur matrix，ECM）的沉積、分解以及細胞凋亡等是組織器官發生纖維化的主要決定因素。ECM的合成與分泌主要由活化的成纖維細胞轉化為肌纖維母細胞（Myofibroblast，MFB）完成，而α-SMA是MFB的標志性抗原[4-6]；CTGF是TGF-β1的重要下游因子，膠原蓄積是ECM沉積的重要表現。因此，α-SMA、CTGF及COLI α1 mRNA的表達能夠在一定程度上反映細胞發生轉分化及IFN-γ對轉分化細胞表型重塑過程中起到的作用。筆者以TGF-β1為誘導劑，誘導奶牛乳腺上皮細胞-肌纖維母細胞轉分化（EMT），以不同濃度的IFN-γ為阻斷劑，探討干擾素-γ（IFN-γ）對奶牛乳腺上皮細胞（BMEC）表型重塑的作用，以期為奶牛乳腺組織重塑的機理研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組人TGF-β1和IFN-γ，均購自Peprotech公司；SYBR Primescipt real-time RT-PCR Kit、RNA iso plus、DNA Marker，購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養。奶牛乳腺上皮細胞由內蒙古農業大學病理學教研室提供，試驗所用細胞為原代培養6～8代凍存細胞。復蘇后待細胞長滿培養瓶底壁80%時，用0.25%胰酶于37 ℃條件下消化4～8 min，以含10%FBS的培養液中止消化，重懸細胞液后進行細胞計數，按5×105個/mL的細胞濃度接種于6孔細胞培養板，待細胞長滿底壁達90%融合時，加入含有0.1%FBS培養液處理24 h后，加入藥物。

1.2.2 試驗分組。試驗分為空白對照組（無血清培養基）、誘導組（TGF-β1 10 ng/mL）、藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）及阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）。每組設3個重復，分別加藥物處理72 h。

1.2.3RT-PCR方法檢測α-SMA、CTGF和COLIα1 mRNA的相對表達量。根據GenBank數據庫中α-SMA 、CTGF、COLIα1和β-actin的序列，利用Primer 5.0軟件設計引物（表1），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用反轉錄試劑中的EASY Dilution對cDNA（500 ng/μL）進行10倍稀釋，做8個稀釋倍數，然后將分別以各稀釋倍數的cDNA 為模板進行RT-PCR檢測，反應體系為：SYBR Primer EX TaqTMⅡ （2×）12.5 μL，PCR 正向引物（10 μmol/L）1 μL，PCR反向引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2，ddH2O 8.5 μL；RT-PCR反應程序為：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環；繪制熔解曲線。選取線性較好的4～6個點制作標準曲線；以β-actin為內參，以等量相應的cDNA為模板，分別平行擴增α-SMA、CTGF和COLⅠ α1 。

1.2.4 數據處理。采用2-△△Ct法對試驗數據進行處理，每個樣品取2次測定的平均值，然后使用SAS 9.0統計軟件進行統計與分析，各組間差異采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CTGF mRNA的相對表達量比較

從圖1可以看出，與對照組相比，誘導組（TGF-β1 10 ng/mL）CTGF mRNA相對表達量明顯升高（P<0.05）；與對照組相比，藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）CTGF mRNA相對表達量受到抑制，但差異并不顯著（P>0.05）；與誘導組相比，阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）CTGF mRNA的表達受到明顯抑制，并呈劑量依賴。

2.2 α-SMA mRNA的相對表達量比較

從圖2可以看出，與對照組相比，誘導組（TGF-β1 10 ng/mL）α-SMA mRNA相對表達量明顯升高（P<0.05）；與對照組相比，藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）α-SMA mRNA相對表達量受到明顯抑制（P<0.05）；與誘導組相比，阻斷組α-SMA mRNA的表達量受到明顯抑制，并呈劑量依賴。

2.3 COLI α1 mRNA的相對表達量比較

從圖3可以看出，與對照組相比，誘導組（TGF-β1 10 ng/mL）COLI α1 mRNA相對表達量明顯升高（P<0.05）；對照組與處理組（IFN-γ 20 ng/mL）BMEC COLI α1 mRNA相對表達量均較低，且差異不顯著（P<0.05）；與誘導組相比，阻斷組COLI α1 mRNA的相對表達量受到明顯抑制，并呈劑量依賴。

3 討論與結論

BMEC參與奶牛乳腺泌乳調控且在乳房炎發病過程中是病原損傷的主要細胞。乳腺纖維化是奶牛乳腺炎重要的病理表現，患病奶牛最終因泌乳功能下降或喪失被淘汰。目前，人類醫學研究表明在多種組織器官纖維化進程中IFN-γ在不同程度上均能起到抑制纖維化的作用。在肝纖維化過程中，IFN-γ能夠降低肝臟星狀細胞（HSC）的活化和細胞外基質的沉積[7-8]；在肺臟纖維化研究中同樣發現，IFN-γ能夠改善肺纖維化的程度，緩解肺臟纖維化進程[9]。纖維化的發生與細胞外基質（ECM）的沉積密切相關，ECM的沉積的主要因素是間質細胞的超量表達和增生，而造成其超量表達的因素目前認為是由間質細胞原發性增殖和實質細胞發生轉分化（EMT）引起。

該試驗用TGF-β1誘導BMEC發生轉分化，探討在IFN-γ 作為藥物逆轉EMT的可能性。結果表明，誘導組（TGF-β1 10 ng/mL）BMEC α-SMA、COLⅠ α1及CTGF的mRNA相對表達量明顯升高，說明誘導試驗是成功的；藥物

組（IFN-γ 20 ng/mL）

BMEC分泌α-SMA和COLⅠα1及TGF-β1下游因子CTGF具有較為明顯的抑制；阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）誘導后BMEC α-SMA、COLⅠα1及CTGF的mRNA相對表達量均受到不同程度抑制，且隨藥物（IFN-γ）添加劑量的增大明顯下降，具有劑量依賴性。這表明IFN-γ能夠抑制肌纖維母細胞（MFB）標志因子α-SMA mRNA的表達，具有對BMEC表型重塑的促進作用；同時，間質細胞蓄積標志COLⅠα1[10] mRNA表達量的下降，表明IFN-γ能夠阻止間質細胞蓄積及膠原的成熟，其作用途徑可能是通過降低TGF-β1的活性，或是抑制TGF-β1下游因子CTGF的合成，或是通過抑制細胞轉分化，減少肌纖維母細胞的數量間接抑制膠原的合成，或是直接抑制膠原的生成，其機理有待進一步驗證。

綜上所述，IFN-γ能夠抑制TGF-β1誘導的EMT，還可抑制細胞外基質成分的產生，其機制可能與IFN-γ參與下調TGF-β1下游因子CTGF的表達有關。該試驗結果可為奶牛乳腺纖維化進程的改善及乳腺纖維化的治療提供新的思路和借鑒。

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