小麥赤霉菌FGSG_03700基因敲除及功能研究

劉超頔 侯占銘

摘要 [目的]敲除小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）FGSG_03700基因，確定其缺失突變體表型，從而分析該基因的生物學功能。[方法]應用Split Marker基因敲除技術，構建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒，通過PEG介導，進行原生質體轉化，在含有潮霉素的培養基上篩選轉化子。[結果]通過PCR正負篩查，得到3個確定的突變體，分別命名為ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。通過表型驗證及孢子對番茄侵染試驗發現，敲除突變體的菌落形態及生長速度沒有明顯變化，致病力沒有減弱，但突變體的產孢量低于野生型PH-1。[結論]FGSG_03700基因可能與小麥赤霉菌分生孢子的生長能力有關。

關鍵詞 小麥赤霉菌；Split Marker；基因敲除；FGSG_03700

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0149-07

Research on Knock-out and Function of FGSG_03700 Gene in Fusarium graminearum

LIU Chao-di， HOU Zhan-ming（College of Life Science and Technology， Inner Mongolia Normal University， Hohhot，Inner Mongolia 010020）

Abstract [Objective] To knock out FGSG_03700 gene in Fusarium graminearum and determine the phenotype of the knock-out mutants so as to analyze the biological function of this gene. [Method]By employing Split Marker gene knockout strategy， gene knock-out cassette containing hygromycin phosphotransferase gene hph was built and transformed into protoplast of wild type PH-1 by PEG-mediated method. [Result] Three mutants were screened by PCR positively and negatively screening named as ΔFGSG_03700 1-2， ΔFGSG_03700 2-2 and ΔFGSG_03700 2-3， respectively. The analysis of phenotype and tomato infection test revealed that there had no evident changes in colony morphology， growth rate and pathogenicity between the mutants and wild type. However， the spore quantity of mutants was significantly lower than PH-1.[Conclusion] FGSG_03700 gene is possibly related to the growth of spore in F.graminearum.

Key words Fusarium graminearum；Split Marker；Gene knock-out；FGSG_03700

小麥赤霉?。‵usarium head blight，FHB）是在世界溫暖潮濕和半潮濕地區麥田廣泛發生的一種毀滅性病害[1]，其致病優勢種為小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）[2]。由小麥赤霉菌在適宜條件下產生的有毒次級代謝產物，即真菌毒素，會導致作物產量銳減，降低谷物質量[3-5]。當其中產生的2種主要真菌毒素——脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）在人畜體內達到一定含量時，會嚴重危害人畜健康[6]。為了從遺傳角度在根本上防治該病害的發生，通過基因敲除技術鑒別某些基因的致病力已成為一種理想的方式。目前，很多相關致病基因已被成功敲除、克隆和鑒定。如1997年敲除并鑒定了與毒素生物合成有關的Tri5基因[7]；2002年Hou等[8]發現了與雌性繁殖、異核體形成有關并在侵染寄主等過程中有重要作用的MGV1基因；2006年Shim等[9]發現了與真菌分泌毒素和雌性繁殖有關的FSR1基因；2011年吳彬[10]敲除FgAC1基因，發現它調控菌絲生長速度與色素合成等。

有絲分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）鏈是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一[11]，MAPKs信號轉導通路對各種生理過程的調控都具有生物進化的高度保守性，通常在大多數細胞內都存在著多條并行的MAPKs信號通路。該信號通路基因編碼Ser、Thr和Tyr蛋白激酶，由MAP3K-MAP2K-MAPK組成，依次通過磷酸化將上游信號傳遞給下游應答分子[12]。MAPKs通路中基因的敲除及功能的鑒定大多是以酵母中的MAPK信號通路為依據的。酵母菌中5條MAPK信號級聯通路分別調節酵母菌的接合生殖、菌絲生長、細胞壁整合、滲透脅迫和胞壁組裝，其中的每條通路都相互獨立，互不交聯[13]。通過轉錄組測序分析得到敲除小麥赤霉菌中MAPK通路上的MGV1基因后的FGSG_03700基因為顯著上調基因，通過基因敲除技術對FGSG_03700基因進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株。

小麥赤霉菌野生型PH-1菌株及質粒pCB1003[含潮霉素磷酸轉移酶基因（hph）]均來源于美國普渡大學，現由內蒙古師范大學生命科學與技術學院分子生物學實驗室保存。

1.1.2 引物設計。從小麥赤霉菌基因數據庫（Fusarium comparative database）中查找FGSG_03700的基因序列[>F.graminearum PH-1（FG3）supercont 3.2 of Gibberella zeae PH-1[DNA] 2939077-2944798 +]，并下載FGSG_03700基因及其上下游2 000 bp的堿基序列，根據下載的基因序列以及hph的堿基序列設計構建基因敲除盒時所需的PCR引物和檢測所需的目的基因內部引物，該試驗引物由上海生工技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

1.1.3試劑、酶及培養基。潮霉素（Hygromycin B，50 mg/mL）、Chitinase（幾丁質酶）、Driselase（崩潰酶）、Lysing enzyme（溶菌酶）均購自Sigma公司；2×Taq PCR Master Mix購于南京博爾迪公司；真菌基因組DNA提取試劑盒（BioFlux）；普通質粒小提試劑盒（離心柱型，TIANGEN）；10×TBE電泳緩沖液、STC buffer、PTC buffer、1.2 mol/L KCl溶液、原生質體（Protoplasting）緩沖液、CMC培養基、YEPD液體培養基、TB3液體培養基、TB3固體培養基、LB液體培養基、LB固體培養基、TCC培養基等[10]。

1.2 方法

1.2.1 pCB1003質粒DNA的提取。從LB固體培養基上挑取該質粒單菌落接種于3 mL LB液體培養基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養12 h左右。之后將菌液轉移至1.5 mL離心管，12 000 r/min離心1 min，保留沉淀。之后的提取步驟按照普通質粒小提試劑盒（離心柱型，TIANGEN）中的提示進行，得到pCB1003的質粒DNA并對其進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 小麥赤霉菌野生型菌株PH-1基因組DNA的提取。將在TCC固體培養基上活化3 d后的野生型小麥赤霉菌PH-1的菌絲接種于YEPD液體培養基中（含Ampicillin），25 ℃、175 r/min振蕩培養4 d。用無菌雙層miracloth過濾該培養基后保留菌絲，用滅菌的濾紙吸干多余的培養液，并將菌絲用錫紙包好，-80 ℃過夜保存后將其從冰箱中取出置于液氮中迅速研磨至粉末狀。之后的操作嚴格按照真菌基因組DNA提取試劑盒的提示進行，得到PH-1基因組DNA并對其進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 FGSG_03700基因敲除盒的構建——Split Marker法。以提取的PH-1基因組 DNA為模板，FGSG_03700 1F/FGSG_03700 2R和FGSG_03700 3F/FGSG_03700 4R為引物對FGSG_03700基因上下游序列進行PCR擴增。以提取的pCB1003質粒DNA為模板，HYG/F-HY/R和YG/F-HYG/R為引物對Hygromycin（hph）基因上下游序列進行PCR擴增。Split Marker重疊PCR擴增時分別以FGSG_03700基因上游PCR擴增產物和hph基因上游PCR擴增產物為模板，FGSG_03700 1F-HY/R為引物；FGSG_03700基因下游PCR擴增產物和hph基因下游PCR擴增產物為模板，YG/F-FGSG_03700 4R為引物進行PCR擴增。所有PCR過程注意選擇適宜的退火溫度及延伸時間，對得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 FGSG_03700基因敲除——原生質體的制備與轉化。將在TCC固體培養基上活化3 d的野生型小麥赤霉菌PH-1的菌絲接種于CMC液體培養基中，25 ℃、175 r/min振蕩培養4 d。使用無菌雙層miracloth將含有孢子的液體過濾后并離心5 min，將沉淀的孢子用YEPD液體培養基重新懸起并全部轉移到該培養基中，25 ℃、175 r/min振蕩培養12 h，此時需嚴格控制時間。12 h后用無菌雙層miracloth過濾，并用1.2 mol/L KCl沖洗4次后用滅菌藥勺將收集到的菌絲放入50 mL無菌離心管中，將現配制好的原生質體Buffer過濾滅菌到裝有菌絲的離心管中，30 ℃、80 r/min振蕩培養約2 h。顯微鏡下制片觀察原生質體釋放情況，達到要求后用無菌雙層miracloth將原生質體過濾至三角瓶中，取70 mL的1.2 mol/L KCl溶液沖洗濾布至瓶內液體為100 mL，25 ℃、4 000 r/min，離心5 min。棄上清，加STC buffer懸浮沉淀并定容至50 mL，混合均勻，25 ℃、4 000 r/min，離心5 min。棄去上清液，加600 μL STC buffer輕輕將沉淀懸起，混合均勻后冰浴6 h。將FGSG_03700基因的重疊PCR產物上下游各取10、300 μL原生質體混合于15 mL無菌離心管中，輕輕混勻后室溫靜置20 min。之后取1.25 mL 40% PTC buffer加入該離心管并混勻，室溫靜置20 min。最后向該離心管中加入5 mL TB3液體培養基（含有50 μg/mL Ampicillin），25 ℃、80 r/min振蕩培養15 h。

1.2.5 ΔFGSG_03700轉化子的篩選及鑒定。將振蕩培養的原生質體取出，25 ℃、4 000 r/min離心5 min，棄去上清液后向離心管中加入10 mL LMT agar TB3固體培養基（含有終濃度250 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin），與原生質體混合均勻后倒入滅菌的90 mm培養皿內，25 ℃過夜培養。之后再向其中加入10 mL LMT agar TB3固體培養基（含有終濃度250 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin），25 ℃繼續培養。3～4 d后長出單菌落轉化子，分別挑取轉化子接種到TCC固體培養基（含有150 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin）上繼續篩選。選取與在TCC固體培養基（含有50 μg/mL Ampicillin）上生長的小麥赤霉菌野生型PH-1單菌落表型有差異的轉化子提取其基因組DNA。之后以提取的轉化子基因組DNA及野生型PH-1基因組DNA作模板，HYG/F-HYG/R、FGSG_03700 1F-HY/R作引物進行PCR正篩，FGSG_03700 N1F/N2R作引物進行PCR負篩，并對得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，只有正負篩選擴增出的條帶均符合預期結果的轉化子才能被確定為正確的敲除突變體。

1.2.6 FGSG_03700敲除突變體表型觀察和致病力檢測。挑取野生型PH-1和敲除突變體FGSG_03700的相同大小的菌絲分別接種于60和90 mm裝有TCC培養基（含50 μg/mL Ampicillin）的培養皿中心，每個菌種各做3個重復，25 ℃，培養3～4 d，觀察60 mm培養皿中菌株生長過程中的形態變化；測量90 mm培養皿中菌株的生長速度，即菌落直徑。將野生型和敲除突變體菌株分別接種于CMC培養基中，每個菌株各做3個重復，25 ℃、175 r/min振蕩培養4 d后制片，顯微鏡下觀察不同分生孢子之間的形態有無不同。之后用無菌雙層miracloth過濾，用血球計數板對含有孢子的濾液進行計數。對洗凈的番茄用75%的乙醇消毒處理，再向其中分別注入10 μL 含有PH-1和ΔFGSG_03700孢子的濾液，深度約1.5 cm，標記，25 ℃靜置培養4 d后，對比二者對蕃茄的侵染情況并拍照記錄，各做3個重復。

2 結果與分析

2.1 pCB1003質粒DNA 取5 μL所提質粒DNA進行0.7%脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker，目的DNA片段長度在4 000～5 000 bp，結果符合預期片段大?。▓D1）。

2.2 野生型小麥赤霉菌PH-1基因組 DNA 取5 μL所提小麥赤霉菌基因組DNA進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker，目的DNA片段長度符合預期結果（圖2）。

2.3 FGSG_03700基因上下游PCR擴增序列

以野生型小麥赤霉菌PH-1菌株的基因組DNA為模板，分別以FGSG_03700 1F/FGSG_03700 2R和FGSG_03700 3F/FGSG_03700 4R為引物對FGSG_03700基因的上、下游序列進行PCR擴增，之后取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker。上游目的片段長度約為575 bp，下游目的片段長度約為649 bp，結果符合預期片段大小（圖3）。

2.4 hph基因上下游PCR擴增序列 以pCB1003質粒DNA為模板，分別以HYG-F/HY-R和YG-F/HYG-R為引物對hph基因的上、下游序列進行PCR擴增，之后取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker。上游目的片段長度約為764 bp，下游目的片段長度約為931 bp，結果符合預期片段大?。▓D4）。

2.5 Split marker重疊PCR擴增序列 以FGSG_03700基因上游PCR產物和hph基因上游PCR產物為模板，以FGSG_03700 1F和HY/R為引物進行PCR擴增，預期片段長度為1 339 bp；以FGSG_03700基因下游PCR產物和hph基因下游PCR產物為模板，以YG/F和FGSG_03700 4R為引物進行PCR擴增，預期片段長度為1 580 bp。之后取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker，結果符合預期片段大?。▓D5）。

2.6 敲除FGSG_03700基因轉化子的PCR正負篩選 將HYG/F和HYG/R、FGSG_03700 1F和HY/R這2對引物用于PCR正向篩選，引物HYG/F和HYG/R擴增產物長度應為1 380 bp，引物FGSG_03700 1F和HY/R擴增產物長度應為1 339 bp，由于敲除突變體中FGSG_03700基因已被hph基因替代，因此在PCR過程中，只有以正確的敲除突變體為模板才能擴增出目的片段，電泳結果有預期條帶，而以野生型PH-1為模板不能擴增出任何片段，電泳結果沒有條帶。以FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R為引物進行的PCR負向篩選，由于引物FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R設計于FGSG_03700基因內部，擴增產物長度應為788 bp，故成功敲除FGSG_03700基因的突變體不再含有該基因，以其為模板進行的PCR擴增不會出現引物FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R之間的片段，電泳結果沒有條帶，而野生型PH-1內仍含有此基因片段，因此以PH-1為模板會擴增出目的片段，電泳結果有預期條帶（圖6～8）。

2.7 FGSG_03700基因敲除轉化子的篩選鑒定

2.7.1 菌落形態。對比在60 mm培養皿中的TCC培養基上生長4 d的野生型PH-1和敲除突變體ΔFGSG_03700的菌落生長情況，發現二者之間的生長過程及形態無顯著差異（圖9）。

2.7.2 菌落生長速度。連續4 d每24 h 1次對培養于90 mm培養皿中的TCC培養基上的野生型PH-1和敲除突變體ΔFGSG_03700的菌落直徑進行測量與記錄，繪制生長曲線圖，發現敲除突變體ΔFGSG_03700的生長速度與野生型菌株PH-1基本沒有差別（圖10）。

2.7.3 產孢量的變化。分別吸取10 μL 在CMC培養基中培養4 d的PH-1和ΔFGSG_03700的分生孢子，用血球計數板進行計數，結果顯示敲除突變體ΔFGSG_03700的孢子數量明顯減少。野生型菌株PH-1的分生孢子量平均為2.5×106個/mL；敲除突變體ΔFGSG_03700 1-2的分生孢子量平均是1.0×106個/mL；敲除突變體ΔFGSG_03700 2-2的分生孢子量平均是1.1×106個/mL；敲除突變體ΔFGSG_03700 2-3的分生孢子量平均是1.0×106個/mL。由此看來，敲除突變體的孢子數比野生型明顯減少。

2.7.4 分生孢子形態觀察。用光學顯微鏡觀察在CMC培養基中生長4 d的野生型菌株PH-1和敲除突變體ΔFGSG_03700的孢子形態，發現二者在形狀、橫膈膜數量、大小等方面基本沒有差別。分生孢子的形態均為鐮刀形，其橫膈膜數為3～7個。顯微鏡拍照對比結果如圖11所示。

2.7.5 分生孢子對蕃茄侵染試驗。分別吸取10 μL在CMC培養基中培養4 d的PH-1和ΔFGSG_03700的分生孢子注入到新鮮的番茄中，培養4 d后觀察到野生型菌株PH-1與ΔFGSG_03700孢子注入的周圍區域都出現腐爛，且注入部位均長出白色菌絲，說明二者均可以侵染番茄，但從腐爛面積來看，二者侵染差異不顯著（圖12）。

3 討論與結論

通過PCR擴增及Split Marker技術構建好基因敲除盒，利用同源重組原理及PEG介導法進行原生質體轉化，使得hph基因取代野生型PH-1中的FGSG_03700基因得到預期的敲除突變體。首先，通過抗藥性的初步篩選，在含有潮霉素的培養基上可以存活并生長的均為轉化子。然后單獨將每一個轉化子培養在含有潮霉素的TCC培養基中，提取轉化子DNA進行PCR驗證以進一步確定目的突變體，采用3組引物進行正負篩查，同時符合3組引物篩查結果的被確認為敲除突變體ΔFGSG_03700。由于小麥赤霉菌營養體是單倍體，故敲除突變體的表型不涉及顯隱性關系，可以直接表達。一般情況下，敲除突變體會有一些區別于野生型的由被敲除基因控制的表型改變。以野生型PH-1作為對照，ΔFGSG_03700敲除突變體的菌落形態無顯著差異；菌落的生長速度基本與野生型持平；從分生孢子對番茄侵染能力的檢測結果發現：二者的侵染面積大致相同，所以FGSG_03700基因的缺失不影響小麥赤霉菌的致病力；敲除突變體的分生孢子形態沒有變化，但產孢量減少，由此推斷FGSG_03700基因可能與小麥赤霉菌分生孢子的生長能力有關。

該試驗通過對敲除突變體的抗藥性篩選以及3組PCR正負篩查，最終得到3個FGSG_03700基因的敲除突變體，分別為ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。將敲除突變體和野生型菌株在表型、生長速度、孢子形態、產孢量和致病力方面進行對比，發現敲除突變體ΔFGSG_03700在生長過程中，菌絲的生長速度及形態與野生型沒有明顯區別，對以番茄為寄主的侵染能力也沒有下降，分生孢子形態沒有變化，但產孢量減少。由此推斷FGSG_03700基因可能與小麥赤霉菌分生孢子的生長能力有關，但該基因的功能尚未完全確定。

參考文獻

[1] 姚金保，陸維忠.中國小麥抗赤霉病育種研究進展[J].江蘇農業學報，2000，16（4）：242-248.

[2] 王裕中，米勒J D.中國小麥赤霉病菌優勢種：禾谷鐮刀菌產毒素能力的研究[J].真菌學報，1994，13（3）：229-234.

[3] DESJARDINS A E，HOHN T M.Mycotoxins in plant pathogenesis[J].Molecular plant-microbe interactions，1997，10（2）：147-152.

[4] DESJARDINS A E，HOHN T M，MCCORMICK S P.Trichothecene biosynthesis in Fusarium species：Chemistry，genetics，and significance[J].Microbiological reviews，1993，57（3）：595-604.

[5] GOSWAMI R S，KISTLER H C.Heading for disaster：Fusarium graminearum on cereal crops[J].Molecular plant pathology，2004，5（6）：515-525.

[6] 張大軍，邱德文，蔣伶活.禾谷鐮刀菌基因組學研究進展[J].安徽農業科學，2009，37（17）：7892- 7894.

[7] JURGENSON J E，BOWDEN R L，ZELLER K A，et al.A genetic map of Gibberella zeae（Fusarium graminearum）[J].Genetics，2002，160（4）：1451-1460.

[8] HOU Z，XUE C，PENG Y，et al.A mitogen-activated protein kinase gene（MGV1）in Fusarium graminearum is required for female fertility，heterokaryon formation and plant infection[J].Molecular plant-microbe interactions，2002，15（11）：1119-1127.

[9] SHIM W B，SAGARAM U S，CHOI Y E，et al.FSR1 is essential for virulence and female fertility in Fusarium verticillioides and F.graminearum[J].Molecular plant-microbe interactions，2006，19（19）：725-733.

[10] 吳彬.小麥赤霉菌FgAC1基因敲除及功能研究[D].呼和浩特：內蒙古師范大學，2011.

[11] GUSTIN M C，ALBERTYN J，ALEXANDER M，et al.MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Microbiology and molecular biology reviews，1998，62（4）：1264-1300.

[12] ZHAO X，MEHRABI R，XU J R.Mitogen-activated protein kinase pathways and fungal pathogenesis[J].Eukaryotic cell，2007，6（10）：1701-1714.

[13] BROWN D W，CHEUNG F，PROCTOR R H，et al.Comparative analysis of 87 000 expressed sequence tags from the fumonisin-producing fungus Fusarium verticillioides[J].Fungal genetics and biology，2005，42（10）：848-861.