寒地水稻紋枯病菌形態特征及ITS鑒定

李修平 馬文東 常瑋 宋成艷 趙雪 張麗敏

摘要 [目的]分離鑒定寒地水稻紋枯病病原菌，為寒地水稻紋枯病抗性育種提供技術支持和理論依據。[方法]采集水稻紋枯病病株并分離培養病菌，采用柯赫氏檢驗法和ITS鑒定的方法，對分離菌株進行形態觀察和分子生物學鑒定。[結果]將分離獲得病菌以牙簽嵌入法接種水稻植株，植株呈現水漬狀典型紋枯病病斑。利用ITS1和ITS4引物擴增病菌DNA，測序結果拼接后與NCBI上已知序列比對，結果表明該菌與登錄號為No.KT362083.1的Rhizoctonia solani（立枯絲核菌）有97%的同源性。[結論]形態學特征鑒定與分子生物學鑒定結果一致，該菌為立枯絲核菌，為寒地水稻紋枯病致病菌。

關鍵詞 寒地水稻；紋枯病菌；形態觀察；ITS鑒定

中圖分類號 S435.111.4+2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0156-03

Morphological Observation and ITS Identification on Rice Sheath Blight （Rhizoctonia solani）in Cold Region

LI Xiu-ping1，MA Wen-dong2，CHANG Wei3 et al （1.School of Life Sciences，Jiamusi，University，Jiamusi，Heilongjiang 154007；2.Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Jiamusi，Heilongjiang 154026；3.Key Laboratory of Soybean Biology of Chinese Education Ministry，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030）

Abstract [Objective] Strain of rice sheath blight in cold region was isolated，and identificated in order to provide technical support and theoretical basis for rice sheath blight resistance breeding.[Method] Diseased plants from rice sheath blight were collected，and strain was isolated and cultured.Morphological observation and molecular identification on strain were carried out by using the method of Koch′s test and ITS identification.[Result] The isolated strain inoculated rice plants with toothpick embedding method，the plants showed hygrophanous typical sheath blight spots.ITS1 and ITS4 primers were used to amplify the strain DNA，sequencing results were compared with known sequences on NCBI，Blast searches results showed a high identity with reference sequences（ITS：97%）.Representative sequences of both regions were deposited to GenBank（ITS：Accession No.KT362083.1）.[Conclusion] Morphological and molecular results confirm this strain as Rhizoctonia solani，the strain is the pathogens of rice sheath blight.

Key words Rice in cold region；Rhizoctonia solani；Morphological observation；ITS identification

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的世界性水稻病害。在我國長江流域和南方稻作區，水稻紋枯病已成為危害嚴重的主要水稻病害之一[1]。20世紀90年代后，由于寒地稻作區施肥水平不斷提高，加之紋枯病菌寄主廣泛、優秀抗源獲得較少等原因，寒地水稻紋枯病造成的產量損失日益嚴重，水稻紋枯病已成為影響寒地稻作區水稻生產的上升性主要病害之一[2]。

目前，寒地水稻紋枯病研究多集中在藥劑防治方面[3-6]，也有少量關于寒地水稻紋枯病發病規律的研究報道[2，7-9]，寒地水稻紋枯病的遺傳研究和育種工作進展較緩慢。使用藥劑防治水稻紋枯病效果一般，而且污染環境、提高農民生產成本，培育抗病優質寒地水稻品種是根本解決辦法。抗性鑒定是寒地水稻紋枯病抗性育種的首要工作，而分離和鑒定寒地水稻紋枯病病原菌是抗性鑒定的前提。真菌性病害的鑒定方法，傳統上是通過對其形態特征、生物學和生理學、致病性特征進行描述。隨著生物技術的發展，同工酶、可溶性蛋白電泳、血清學技術、分子標記技術以及rDNA-ITS序列分析技術不斷在病原菌鑒定和遺傳學分析中廣泛應用[10]。rDNA-ITS是目前分子系統性廣泛采用的標記基因之一，近年來rDNA-ITS序列分析技術因其兩側編碼區的高度保守性及操作方法簡便、鑒定結果準確等特點而被應用于各類真菌性病害的分類鑒定和遺傳多樣性分析中[11-14]。筆者通過形態學特征觀察和ITS鑒定的方法，對采集于寒地的水稻紋枯病病株進行了病原菌分離與鑒定，以期為寒地水稻紋枯病抗性育種提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻紋枯病菌。2014年采集于黑龍江省農業科學院佳木斯水稻研究所紋枯病發病植株，于黑龍江省農業科學院佳木斯分院病理研究室進行分離培養保存[15]。

1.1.2 病菌接種植物材料。收集30份寒地水稻種質資源，采用大田管理，每個品種種植2行，行長1 m；旱育秧，插秧規格為30 cm×10 cm。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化及形態特征觀察。

采集水稻紋枯病發病植株，采用常規組織分離法，從發病葉鞘的病健交界處進行分離。分離得到的菌株經純化后在PDA上進行培養和形態觀察，并置于0～4 ℃冰箱保存備用。

將編號SB-2的菌株置于PDA平板上，于光照培養箱中進行28 ℃光暗交替培養，觀察菌落、菌核形態特征，生物顯微鏡下觀察菌絲形態，參考文獻[16]進行病原菌鑒定。

1.2.2 致病性測定。

按照柯赫氏法則，對健康的寒地水稻種質資源進行接種，并設無傷對照，對分離菌株進行致病性測定。接種方法參照潘學彪等[17]提出的牙簽嵌入法，將木質牙簽剪成長0.8～1.0 cm的小段，鋪于培養皿底部，加入適量PDA培養基，覆蓋牙簽以厚度0.5～1.0 cm為宜，121 ℃高壓滅菌15 min，接種，28 ℃培養3～5 d，待菌絲密集地布滿培養基時進行田間接種，每個品種接種3株，每稻叢接種3個莖稈，并掛標簽。用鑷子將短牙簽自上向下嵌入接種莖稈第2～3葉鞘，由于該2個葉鞘不再伸長，并且接種后葉鞘抱莖狀態未被改變，故植株呈自然狀態。

1.2.3 病原菌再分離。

從接種后發病水稻植株葉鞘上分離培養病原菌，對其形態特征與最初接種病原菌菌株進行比較。

1.2.4 病原菌的ITS鑒定分析。

1.2.4.1 病原菌DNA提取。在PDA固體培養基上接種病原菌，置于28 ℃培養7 d，刮取菌絲或菌核，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA。

1.2.4.2 病原菌rDNA-ITS序列分析。采用真核生物核糖體 DNA 通用引物 ITS1/ITS4 進行擴增。序列：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR 反應體系（25.00 μL）：5 mmol/L MgCl2 2.50 μL，10×buffer 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.00 μL，20 μmol/L引物0.25 μL，10 U/μL Taq 聚合酶0.25 μL，15 ng/μL模板DNA 3.00 μL，ddH2O 15.50 μL。

PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環30次；72 ℃延伸 10 min。陰性對照用 ddH2O 代替模板 DNA，PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測后，將擴增的菌株 PCR 產物送黑龍江博凱實驗設備有限公司進行正反向雙向測序。

1.2.4.3 序列比對分析。將PCR測序結果利用DNAMAN軟件進行處理，獲得DNA序列與NCBI數據庫上已知序列比對分析，進行病原菌的同源性分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態學特征

菌株SB-2在PDA培養基上28 ℃培養4 d后，菌落可長滿皿，菌絲生長迅速，菌絲體初期無色，后期變淡褐色，分枝與主枝呈銳角或直角，分枝處有縊縮。成熟菌核淡褐色至褐色，半球形或類球形，菌核表面常有黏液分泌，常多個菌核聚合成團，菌核呈深褐色圓形或不規則形，較緊密（圖1）。

2.2 菌株SB-2的致病性

菌株SB-2采用成株期牙簽嵌入法，于水稻植株分蘗末期接種于30份寒地水稻種質資源，接種36 d后調查，接種水稻植株在近水面的葉鞘上出現水漬狀橢圓形斑，為水稻紋枯病典型病斑特征（圖2）。將接種后發病水稻植株進行病原菌的再次分離培養，獲得與原菌株形態一致的病原菌。對照植株未表現出紋枯病發病癥狀。根據柯赫氏法則，菌株SB-2為水稻紋枯病致病菌。

2.3 水稻紋枯病ITS序列分析鑒定

利用ITS通用引物對病原菌菌株SB-2提取的基因組DNA進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得750 bp的片段，回收該片段并雙向測序，測序結果處理后與NCBI數據庫進行Blast比對，在GenBank中已知序列進行同源性分析，發現該病原菌ITS序列與登錄號為KT362083.1的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-1-IA）同源性高達97%，表明該菌為Rhizoctonia solani，為寒地水稻紋枯病致病菌。

3 結論與討論

對2014年采集的水稻紋枯病發病植株進行病原菌分離培養并獲得菌株SB-2，通過形態特征觀察、柯赫氏法則致病性鑒定，接種該菌株后水稻植株呈現紋枯病水漬狀病斑，表明該菌株為寒地水稻紋枯病致病菌；采用rDNA-ITS序列進行分子鑒定，菌株SB-2序列與登錄號為No.KT362083.1的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-1-IA）同源性高達97%，該菌株為寒地水稻紋枯病致病菌，形態特征鑒定結果與ITS分子鑒定結果一致。

傳統的真菌分類鑒定主要依靠真菌的形態特征及生理生化特征等描述，但由于其種類眾多、個體多態性差異明顯等原因，常會出現假陽性或假陰性結果[18]。隨著分子生物學的迅速發展，真菌的分類中引入了rDNA-ITS序列分析技術，核糖體DNA轉錄間隔序列進化速度快、種間變異豐富，該技術具有操作簡便、特異性好、結果準確、GenBank和EMBL數據庫儲存大量序列信息可供查詢等特點，被廣泛應用于病原菌的鑒定及分類、遺傳多樣性等研究[19-20]。

融合菌群測定是目前絲核菌分類的另一有效方法，可獲得菌的種屬鑒定甚至是亞類的鑒定結果，但具有菌絲融合現象復雜、融合標準難以判斷準確、鑒定過程復雜、時間長等缺點[21]。將ITS快速分子鑒定方法與融合菌群分類細致準確的測定方法相互結合、相互驗證，能夠更加準確有效地開展病原菌鑒定工作。

水稻紋枯病對寒地水稻生產危害不斷加重，而關于寒地水稻紋枯病病原菌鑒定分離的研究鮮見報道，確定寒地水稻紋枯病病原菌分類及獲得病原菌菌種，對于寒地水稻紋枯病抗性育種具有重要意義，可為其提供抗性鑒定技術工具，為寒地水稻紋枯病遺傳、發病規律研究及防治提供理論依據。

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