毒死蜱降解菌的篩選?鑒定?降解特性

羅鑫 張海燕 邵彪 劉明元

摘要[目的]篩選毒死蜱降解菌，了解其特性。[方法]從常年施用毒死蜱農藥的水稻田土壤中篩選出1株能以毒死蜱為唯一碳源和能源的降解菌。[結果]降解菌DC1對濃度100 mg/L毒死蜱15 d的降解率可達到83.3%。通過16S rDNA序列同源性和系統發育分析，將該毒死蜱降解菌鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。系統發育表明，該菌和枯草芽孢桿菌的分支特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）的親緣關系最近。[結論]降解菌DC1來源于土壤，適應性強，對解決土壤中毒死蜱殘留有一定的應用價值。

關鍵詞毒死蜱；生物降解；16S rDNA；枯草芽孢桿菌

中圖分類號S482.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）19-0056-02

Isolation，Identification and Degrading Characteristics of A Chlorpyrifos Degrading Bacteria DC1

LUO Xin1，2，ZHANG Haiyan2，SHAO Biao1 et al

（1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute，Nantong，Jiangsu 226002； 2.Changzhou Environmental Monitoring Center，Changzhou，Jiangsu 213001）

Abstract[Objective]To screen chlorpyrifos degrading bacteria and understand their characteristics.[Method]A strain capable of utilizing chlorpyrifos as the sole carbon and energy sources was isolated form Chlorpyrifos used paddy soil.[Result]The results showed that the degradation rate of Chlorpyrifos was at 83.3% in liquid culture medium with 15 days.The phylogenetic analysis and 16S rDNA gene sequence analysis were applied to the bacteria classification，the strain was identified as Bacillus subtilis.The phylogenetic analysis also showed that the genetic relationship between strain DC1 and Bacillus tequilensis was propinquity.[Conclusion]The degrading bacteria DC1 was derived from soil and has strong adaptability，and has certain application value for solving soil poisoning ticks residue.

Key wordsChlorpyrifos；Biodegradation；16S rDNA；Bacillus subtilis

毒死蜱學名氯吡硫磷，是一種高效、廣譜、中等毒性的有機磷酸酯類殺蟲殺螨劑，也是目前世界上生產和銷售量最大的殺蟲劑之一。在我國，毒死蜱廣泛應用于水稻、蔬菜、瓜果類農產品，尤其在禁止甲胺磷、對硫磷等5種高毒農藥的銷售和使用后，毒死蜱的使用更加廣泛和頻繁。然而，農藥的實際利用率極低，只有1%～10%施在作物上被利用，其余90%以上的農藥或殘留于植物和土壤或進入水體[1]。毒死蜱能夠通過皮膚接觸或呼吸作用進入人體，并且在人體內有累積現象，影響人的呼吸系統、心血管系統和神經系統，并有一定的致畸性[2-4]。其在植物和土壤中殘留可通過食物鏈影響人們的健康[5]。

利用微生物降解環境中農藥含量是一種高效、安全的方法，目前國內外已有一些關于毒死蜱降解菌的報道。周淑云[6]從山東泰安某農藥廠排污口的土壤中分離到1株施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）可降解毒死蜱；張利等[7]從農藥廠廢水處理池污泥中分離到1株對毒死蜱有較強降解能力的菌株CH3，初步鑒定為哈夫尼菌屬（Hafnia sp.）。筆者以長期施用毒死蜱農藥的稻田土壤作為菌種來源，從中篩選出高效降解毒死蜱的菌株，同時因菌種來源于土壤，有較強的適應性能夠適應土壤環境，對微生物法降解毒死蜱尤其是解決土壤中毒死蜱殘留有較高的應用價值。

1材料與方法

1.1儀器與設備

恒溫振蕩培養箱（太倉市實驗設備廠）；恒溫培養箱（上海實驗儀器總廠）；壓力蒸汽滅菌器（上海醫用核子儀器廠）；標準凈化工作臺（上海賀德實驗設備廠）；顯微鏡（1 000倍）；氣相色譜（安捷倫）。

1.2培養基

分離馴化培養基（MM培養基）：FeCl3·6H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4NO3 0.5 g，KH2PO4 0.4 g，Na2HPO4 1.0 g，蒸餾水1 L。富集培養基（NB培養基）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g（固體培養基時加入）、蒸餾水1 L。所有培養基均需調節pH至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3毒死蜱降解菌的篩選

菌種來源于江蘇省南通市海安縣里下河地區常年耕種水稻并頻繁施用毒死蜱農藥的田間，采樣深度為5～10 cm，采樣后碾散，于4 ℃保存。向50 mL含毒死蜱50 mg/L MM培養基中加入5 g土壤，于30 ℃ 120 r/min搖床培養3 d，取該混合液2 mL轉接入新鮮的MM培養基中，提高毒死蜱濃度至100 mg/L，3 d后再轉接并提高毒死蜱濃度至200 mg/L，繼續培養3 d，再重復轉接至毒死蜱濃度200 mg/L MM培養基中。將馴化后的菌液梯度稀釋1 000倍，吸取100 μL涂布至毒死蜱濃度200 mg/L NB固體培養基上，于30 ℃恒溫培養3 d，挑取單菌落連續轉接3次。

1.4分離菌株鑒定

測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成，測序結果分別從上下游向中間進行拼接。將獲得的16S rDNA菌株序列在NCBI網上進行BLAST分析，與GenBank數據庫中的基因序列進行同源性比較分析。使用MEGA 5.0軟件采用鄰位連接法（Neighbour Joining）繪制系統發育樹。

1.5毒死蜱的提取與檢測

毒死蜱的提取與檢測方法參照文獻[8]。

2結果與分析

2.1降解菌的分離和篩選

在對馴化后的菌液進行涂布后，固體培養基上有一些菌落生長，觀察其菌落特征可知，均極為相似，挑取其中1株單菌落連續轉接，獲得1株純化的毒死蜱降解菌，命名為DC1。DC1在NB平板上的菌落為乳白色，不透明，呈圓形，邊緣不整齊，表面粗糙。

2.2菌株DC1的系統發育

BLAST的結果顯示與菌株DC1最為相似的均為芽孢桿菌，相似度均超過99%，因此確定DC1為芽孢桿菌屬。圖1是根據菌株DC1的16S rDNA序列與同源性最高有代表性的15株菌構建的系統發育樹。同源性分析和系統進化表明，DC1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）最為相似。

2.3菌株DC1對毒死蜱的降解率

蘸取NB平板上的DC1單菌落至NB液體培養基，于30 ℃ 120 r/min培養48 h，此為降解菌菌劑。向100 mL含毒死蜱100 mg/L無機鹽培養基中加入5 mL菌劑，于30 ℃ 120 r/min培養15 d，分別在第5、10、15天吸取20 mL培養基測定毒死蜱的濃度。結果表明，第5、10、15天培養基中毒死蜱的濃度分別為58.9、32.4、16.7 mg/L，對毒死蜱的降解率分別為41.1%、67.6%、83.3%。

3結論與討論

（1）

從常年施用毒死蜱農藥的水稻田土壤中篩選出1株能以毒死蜱為唯一碳源和能源的降解菌DC1，該菌對濃度100 mg/L毒死蜱第5、10、15天的降解率分別達到41.1%、67.6%、83.3%。通過16S rDNA序列同源性和系統發育分析，可將該毒死蜱降解菌鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。枯草芽孢桿菌實際上是一個表型相似的群體，即枯草芽孢桿菌近緣種群（簡稱枯草群），他們包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）等10余個亞種，特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）也是其中之一。分離菌株DC1的系統發育樹表明，該菌和枯草芽孢桿菌的分支Bacillus tequilensis的親緣關系最近。

（2）微生物降解被認為是農藥尤其是有機磷農藥降解最安全最可靠的途徑，分離和篩選出毒死蜱高效降解菌是毒死蜱污染治理、土壤修復的有效措施。該研究分離菌株DC1來源于土壤，能夠適應土壤環境，對解決土壤中毒死蜱殘留有一定的應用價值。

參考文獻

[1]

李陽，王玉玲，李敬苗.有機農藥對土壤的污染及生物修復技術研究[J].中國環境管理干部學院學報，2009，19（3）：64-66.

[2] PERERA F P，RAUH V，WHYATT R M，et al.A summary of recent findings on birth outcomes and developmental effects of prenatal ETS，PAH，and pesticide exposures[J].Neurotoxicology，2005，26（4）：573-587.

[3] SHERMAN J D.Chlorpyrifos （Dursban）associated birth defects：Report of four cases[J].Archives of environmental health，1996，51（1）：5-8.

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[5] KULKAMI A R，SOPPIMATH K S，DAVE A M，et al.Solubility study of hazardous pesticide （chlorpyrifos） by gas chromatography[J].Journal of hazardous materials，2000，80（1/2/3）：9-13.

[6] 周淑云.毒死蜱高效降解菌的分離鑒定及其生物學特性研究[D].重慶：西南大學，2006.

[7] 張利，劉紅玉，曾光明，等.一株毒死蜱降解菌的分離鑒定及降解性能研究[J].環境工程學報，2008，2（10）：1421-1424.

[8] 楊麗，趙宇華，張炳欣，等.一株毒死蜱降解菌的分離鑒定及其在土壤修復中的應用[J].微生物學報，2005，45（6）：905-909.

安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（19）：58-61，65